整合素CD11b抑制樹突狀細(xì)胞抗原交叉提呈的機(jī)制研究.pdf

1、免疫活化和免疫耐受極大地依賴于抗原提呈的程度與免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)，作為專職的抗原提呈細(xì)胞和適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)的始動(dòng)者，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)可以攝取、加工處理外源性抗原并以MHC-II類分子抗原肽復(fù)合物的形式提呈給CD4+T細(xì)胞。除此之外，DCs也可以將抗原以MHC-I類分子提呈給CD8+T細(xì)胞，即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)，這種特殊的抗原提呈方式被稱為抗原交叉提呈

2、反應(yīng) (cross-priming)。已知DCs在病毒入侵、細(xì)菌感染以及腫瘤浸潤的免疫防御反應(yīng)中均發(fā)揮著重要的作用，而在此過程中，DCs分泌的IL-12p70不僅能促進(jìn)CTL免疫突觸的形成，還可以延長CTL-DC的相互作用從而促進(jìn)CTL的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生。DC初始化CTL的抗原交叉提呈反應(yīng)可以在多個(gè)層面被調(diào)控，比如活化的共刺激信號(hào)和減弱的促凋亡信號(hào)均能增強(qiáng)抗原交叉提呈反應(yīng)，但是仍有很多調(diào)控抗原交叉提呈反應(yīng)的正向和負(fù)向調(diào)節(jié)子亟待發(fā)現(xiàn)

3、和進(jìn)一步深入研究。
　　 Β2整合素(CD11/CD18)在免疫反應(yīng)和炎癥過程中均發(fā)揮了重要的作用。根據(jù)其不同的α亞基，可以將其分為4種功能不同的異二聚體，分別為：白細(xì)胞功能相關(guān)性抗原(leukocyte function-associated antigen 1, LFA-1; CD11a/CD18, αLβ2 integrin, ITAlantigen), Mac-1(CD11b/CD18, αMβ2 integrin, I

4、TAM antigen), p150,95 (CD11c/CD18, αXβ2 integrin, CR4, ITAX antigen)和αDβ2 (CD11d/CD18, ITAD antigen)。其中CD11b廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞亞群，如DCs、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等，并參與了細(xì)胞活化、細(xì)胞趨化、細(xì)胞毒和吞噬等多種生物學(xué)過程。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明CD11b可以分別通過負(fù)向調(diào)控NK細(xì)胞的TLR3信號(hào)通路和巨噬

5、細(xì)胞的TLR4信號(hào)通路來維持免疫耐受并抑制炎性反應(yīng)。CD11b同樣高表達(dá)于DC表面，已有研究表明DC表面的CD11b可以抑制DC初始的CD4+T細(xì)胞活化并通過破壞Th17的分化促進(jìn)外周耐受的形成。這些結(jié)果表明CD11b在調(diào)控T細(xì)胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用至關(guān)重要。在CTL活化過程中，普遍為大家多接受的是，TLR4配體LPS和TLR9配體CpG-ODN可以增強(qiáng)DC初始的CTL抗原交叉提呈反應(yīng)，然而有關(guān)CD11b在抗原交叉提呈反應(yīng)中的作用為何

6、目前尚不知曉。
　　 作為DC表面重要的兩個(gè)TLR受體，TLR4和TLR9均可以促進(jìn)DC成熟及其炎性因子分泌，但它們卻依賴于不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在DC中，LPS主要以MyD88（myeloid differentiation factor 88）依賴的方式促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生，而通過TRIF（TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β）接頭分子誘導(dǎo)共刺激分子的上調(diào)，如CD40、CD80

7、和CD86等。TLR9啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)則是特異性的通過接頭分子MyD88來活
　　 化NF-κB和MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致DC的成熟和炎性因子的分泌。
　　 miRNAs（MicroRNAs）是一種非編碼的具有調(diào)節(jié)功能的RNA，它們可以通過抑制轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)mRNA降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。在天然免疫、炎癥反應(yīng)和病毒感染等進(jìn)程中，miR-146a發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。TLR信號(hào)通路的活化和

8、炎性刺激均可以導(dǎo)致miR-146a的上調(diào)，繼而依賴一些已知的靶調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，如IL1-R-associated kinase (IRAK) 1, IRAK2, TNFR-associated factor (TRAF) 6和Tata Binding Protein (TBP)等。已有研究表明，miR-146a的上調(diào)主要是依賴于NF-κB活化，但其具體精細(xì)的調(diào)控機(jī)制知之甚少，此外，一個(gè)單獨(dú)的miRNA可以靶向多個(gè)mRNA發(fā)揮生物學(xué)功能，所

9、以仍然有很多miR-146a的潛在的靶亟待發(fā)現(xiàn)并鑒定其功能。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照小鼠DC相比，CD11b缺陷小鼠DC在TLR9激動(dòng)劑刺激下IL-12p70明顯上調(diào)，同樣該DC初始的CTL抗原交叉提呈反應(yīng)也顯著增加，表現(xiàn)為CTL進(jìn)一步增殖和IFN-γ分泌增加，這就表明CD11b在該過程中發(fā)揮著一種負(fù)向調(diào)節(jié)功能。進(jìn)一步探討其機(jī)制發(fā)現(xiàn)CD11b參與了TLR9介導(dǎo)的miR-146a上調(diào)，DC中上調(diào)的miR-146a進(jìn)一

10、步靶向Notch1從而抑制了IL-12p70的產(chǎn)生，因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了CD11b具有抗原交叉提呈反應(yīng)調(diào)控作用的新功能并對于其作用機(jī)制有了初步的認(rèn)識(shí)。
　　 1.CD11b通過抑制TLR9激動(dòng)劑觸發(fā)的IL-12p70而減弱抗原交叉提呈反應(yīng)
　　 為了探究CD11b對抗原交叉提呈反應(yīng)的影響，我們首先制備了正常小鼠和CD11b缺陷小鼠的骨髓來源的樹突狀細(xì)胞（Bone marrow-derived dendritic c

11、ells, BMDC），分別用TLR4激動(dòng)劑LPS和TLR9激動(dòng)劑CpG-ODN刺激一天誘導(dǎo)其成熟而作為抗原提呈細(xì)胞，然后分選OT-I小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，負(fù)載OVA抗原后與maDCs （mature DCs）共培養(yǎng)，以此來模擬抗原交叉提呈反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CD11b缺陷小鼠在CpG-ODN刺激后可以通過促進(jìn)CTL的增殖以及IFN-γ的分泌來增強(qiáng)抗原交叉提呈反應(yīng)，而LPS刺激情況下則無明顯改變，表明CD11b抑

12、制了TLR9激動(dòng)劑而非TLR4激動(dòng)劑誘導(dǎo)的抗原交叉提呈反應(yīng)。
　　 為了進(jìn)一步明確其具體機(jī)制，我們首先利用流式細(xì)胞儀對比了正常小鼠和CD11b缺陷小鼠DC的表型，結(jié)果無論是imDCs （immature DCs）還是LPS或CpG-ODN刺激后的DC，其上的MHC-I、MHC-II、CD40、CD70、CD80和CD86均沒有明顯改變，表明CD11b并非通過影響DC表型發(fā)揮作用，隨后借助ELISA，我們對比了兩種DC在TLR4和

13、TLR9激動(dòng)劑刺激后IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)情況，結(jié)果依然沒有顯著差異，但是CD11b缺陷小鼠DC在TLR9激動(dòng)劑刺激情況下IL-12p70卻顯著上調(diào)，且特異性IL-12p70中和性抗體能減弱正常小鼠DC和CD11b缺陷小鼠DC所誘導(dǎo)的抗原交叉提呈反應(yīng)并縮小其組間差異，因?yàn)橹T多研究表明IL-12p70可以增強(qiáng)CTL活化，所以，該部分結(jié)果表明CD11b通過抑制TLR9激動(dòng)劑觸發(fā)的IL-12p70進(jìn)而減弱抗原交叉提呈反應(yīng)。

14、r>　　 2.CD11b促進(jìn)CpG-ODN誘導(dǎo)的miR-146a上調(diào)依賴于NF-κB的晚期活化
　　 CD11b缺失后只改變了IL-12p70的分泌而對DC表型和炎性因子產(chǎn)生均無明顯影響，表明CD11b很有可能并非直接調(diào)控DC內(nèi)TLR9信號(hào)通路，而是借助一些其他途徑和機(jī)制特異性的調(diào)節(jié)了IL-12p70的產(chǎn)生。
　　 鑒于miRNA可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，我們挑選了一些候選miRNA進(jìn)行檢測來驗(yàn)證是否CD11b通過

15、改變miRNA的表達(dá)調(diào)控了IL-12p70的分泌。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-21可以直接調(diào)控IL-12p35，然而在我們的體系中CD11b缺陷與否對其表達(dá)豐度并無影響，miR-146a和miR-155都可以在TLR配體刺激下上調(diào)，通過實(shí)時(shí)定量PCR我們發(fā)現(xiàn)，無論CD11b缺陷與否，LPS和CpG-ODN均能有效的誘導(dǎo)miR-155上調(diào)，而DC中CD11b缺失后特異性的抑制了CpG-ODN誘導(dǎo)的miR-146a上調(diào)，而對LPS刺激的miR-14

16、6a上調(diào)無影響，且pri-miR-146a的表達(dá)趨勢與miR-146a一致表明CD11b在轉(zhuǎn)錄水平參與調(diào)控了miR-146a的上調(diào)。此外NF-κB抑制劑PDTC可以有效的阻斷正常小鼠DC中CpG-ODN誘導(dǎo)的miR-146a上調(diào)，提示CD11b以NF-κB依賴的方式輔助了miR-146a上調(diào)。同時(shí)通過免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)我們動(dòng)態(tài)觀測了CpG-ODN刺激后，正常小鼠DC和CD11b缺陷小鼠DC的NF-κB活化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD11b并未影響早

17、期的NF-κB的活化，從而解釋了炎性因子沒有改變的原因，而CD11b缺失后NF-κB的晚期活化明顯減弱，導(dǎo)致了miR-146a無法上調(diào)。
　　 3.miR-146a通過靶向Notch1抑制CpG-ODN誘導(dǎo)DC產(chǎn)生的IL-12p70
　　 miRNA主要通過靶向mRNA發(fā)揮生物調(diào)節(jié)功能，且已知的miR-146a的靶IRAK1、IRAK2、TRAF6和TBP貌似不會(huì)調(diào)控IL-12p70的分泌，所以很有可能存在miR-146

18、a的新靶調(diào)控了IL-12p70的表達(dá)，通過TargetScan（http://www.targetscan.org），我們對miR-146a的作用靶分子進(jìn)行了預(yù)測，并發(fā)現(xiàn)Notch1在各種屬間擁有保守的miR-146a結(jié)合位點(diǎn)，且已有研究表明TLR的活化可以激活Notch1信號(hào)，且Notch1的活化與M1型巨噬細(xì)胞高分泌IL-12p70存在正相關(guān)，提示miR-146a很有可能靶向Notch1抑制IL-12p70的產(chǎn)生，通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對

19、其進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與mimic control相比miR-146a mimic能顯著抑制含miR-146a結(jié)合位點(diǎn)的Notch1的3’UTR區(qū)正常報(bào)告基因質(zhì)粒的活性，而對結(jié)合位點(diǎn)突變組無明顯差別，表明miR-146a確實(shí)可以靶向Notch1。
　　 接下來我們比較了對照組與CD11b缺陷組DC的Notch1全長片段（Notch FL）和Notch1胞內(nèi)段（Notch intracellular domain, NICD）的固

20、有表達(dá)情況以及在CpG-ODN刺激后的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，靜息情況下，CD11b缺陷組DC的Notch FL和NICD1的表達(dá)即高于對照組，而CpG-ODN刺激后Notch FL和NICD1均明顯上調(diào)且在CD11b缺陷組上調(diào)更為明顯，表明CD11b很有可能通過抑制Notch1的表達(dá)來減少IL-12p70的分泌。此外，為了驗(yàn)證miR-146a對Notch1的影響，在將miR-146a mimic、mimic control、miR-146

21、a inhibitor和inhibitor control轉(zhuǎn)染至CD11b缺陷DC和正常DC之后我們分別在RNA水平和蛋白水平檢測了Notch1的表達(dá)情況，結(jié)果與預(yù)期的情況一致，miR-146a mimic明顯抑制了Notch1的表達(dá)，而miR-146a inhibitor正好相反，表明在DC中Notch1確實(shí)是miR-146a的一個(gè)新靶，通過轉(zhuǎn)錄抑制和mRNA降解的機(jī)制被miR-146a所調(diào)控。
　　 隨后通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)我

22、們發(fā)現(xiàn)，無論是在正常小鼠DC還是CD11b缺陷小鼠DC，干擾Notch1后可明顯降低CpG-ODN誘導(dǎo)的IL-12p70的分泌，表明Notch1參與了CpG-ODN誘導(dǎo)的IL-12p70產(chǎn)生。最后為了驗(yàn)證miR-146a是否對CpG-ODN誘導(dǎo)的IL-12p70同樣具有調(diào)控作用，我們在轉(zhuǎn)染miRNA之后檢測了IL-12p70的變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-146a mimic過表達(dá)miR-146a后，較正常組CD11b缺陷小鼠DC組CpG-

23、ODN刺激分泌的IL-12p70顯著下調(diào)，而較CD11b缺陷小鼠DC正常小鼠DC轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor后IL-12p70明顯上調(diào)，可見CD11b的確通過輔助miR-146a的上調(diào)繼而靶向Notch1來抑制了CpG-ODN觸發(fā)的IL-12p70產(chǎn)生。
　　 結(jié)語：綜上所述，CD11b參與、輔助了CpG-ODN誘導(dǎo)DC中miR-146a上調(diào)并由此靶向Notch1繼而抑制了IL-12p70的產(chǎn)生，最終減弱了DC的抗原