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文檔簡介
1、目的:糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(DiabetesMellitus,DM)造成的嚴(yán)重和危害性較大的一種慢性并發(fā)癥。其發(fā)病機制與慢性炎癥有關(guān),動物實驗和DN臨床患者的研究中均發(fā)現(xiàn)腎臟組織大量浸潤的炎癥細(xì)胞以巨噬細(xì)胞為主。其浸潤程度與腎組織的損害程度趨勢一致呈正相關(guān)。因此,巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是加快DN發(fā)展的重要原因之一。TLR4是巨噬細(xì)胞表面的模式識別受體, TLR4信號通路在DN的發(fā)病中的作用
2、逐漸受到人們的關(guān)注,許多臨床和實驗均表明TLR4在高糖狀態(tài)下表達(dá)增高。生理條件下LPS結(jié)合巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面的TLR4可誘導(dǎo)促炎信號和抗炎信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),分別產(chǎn)生促炎因子TNF-α、IL-β和抗炎因子IL-10,來維持炎癥因子的平衡。那么,在糖尿病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的TLR4的激活是否改變了這種平衡狀態(tài),導(dǎo)致DN的發(fā)生呢?目前還未見詳細(xì)報道。因此,本課題依據(jù)前期結(jié)果和文獻資料,在體外用高糖培養(yǎng)巨噬細(xì)胞,用TLR4的不同配體進行刺激,觀
3、察TLR4介導(dǎo)的促炎和抗炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá),探討高糖對巨噬細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,明確巨噬細(xì)胞在DM和DN發(fā)生中的炎癥機制。
方法:
1、經(jīng)PMA活化的THP-1細(xì)胞同時用正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,再用LPS刺激,在0、2、4、8、16、24小時收集細(xì)胞。用Real-timePCR檢測炎癥因子IL-10、IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)水平。
2、經(jīng)PMA活化的THP-1細(xì)胞同時用正
4、常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,再用LPS刺激,在0、2、4、8、16、24小時收集細(xì)胞上清;用HSP60刺激24h收集細(xì)胞上清用ELISA檢測炎癥因子IL-10、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平。
3、經(jīng)PMA活化的THP-1細(xì)胞同時用正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,再用LPS刺激,在0、15、30、60、120、180min收集細(xì)胞。另一組用LPS和HSP60刺激,在0、30、60、180min收集細(xì)胞,用Wes
5、ternblot檢測p110δ、P-NF-κB p65、NF-κB p65、P-AKT、AKT的表達(dá)水平。
結(jié)果:
1、與空白對照組相比,IL-10mRNA正常組與高糖組在2h、4h時表達(dá)明顯增高,IL-1β mRNA正常組與高糖組在2h、4h、8h時表達(dá)明顯增高,TNF-αmRNA的正常組與高糖組在2h、4h、16h、24h時表達(dá)明顯增高。對照組IL-10mRNA表達(dá)量的高峰值出現(xiàn)在LPS刺激后的2小時,高糖組出現(xiàn)
6、在4小時,出現(xiàn)延遲現(xiàn)象。高糖組在4小時IL-1βmRNA表達(dá)量明顯高于正常組。高糖組在2小時TNF-α mRNA表達(dá)量顯著高于正常組。
2、上清ELISA結(jié)果,IL-10無明顯變化,LPS刺激時,IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生隨著時間延長均逐漸升高,且高糖組在任一時間點均高于正常組。LPS和HSP60同時刺激24h時,LPS刺激下IL-1β、TNF-α變化顯著,且高糖組高于正常組,HSP60刺激下變化不明顯。
3、We
7、stern blot結(jié)果顯示:LPS刺激細(xì)胞0、15、30、60、120、180min,P-NF-κB p6515分鐘時表達(dá)量增加,正常組60分鐘,高糖組15分鐘時時達(dá)到高峰,P-AKT60分鐘時表達(dá)增高,高糖組在同一時間點總體高于正常組;LPS和HSP60刺激細(xì)胞0、30、60、180min,高糖狀態(tài)下p110δ無論在LPS還是HSP60刺激下表達(dá)水平降低,P-NF-κB p65、P-AKT在LPS的作用下變化明顯。
結(jié)論:
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