高糖對巨噬細胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是糖尿病(DiabetesMellitus，DM)造成的嚴重和危害性較大的一種慢性并發(fā)癥。其發(fā)病機制與慢性炎癥有關(guān)，動物實驗和DN臨床患者的研究中均發(fā)現(xiàn)腎臟組織大量浸潤的炎癥細胞以巨噬細胞為主。其浸潤程度與腎組織的損害程度趨勢一致呈正相關(guān)。因此，巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是加快DN發(fā)展的重要原因之一。TLR4是巨噬細胞表面的模式識別受體， TLR4信號通路在DN的發(fā)病中的作用

2、逐漸受到人們的關(guān)注，許多臨床和實驗均表明TLR4在高糖狀態(tài)下表達增高。生理條件下LPS結(jié)合巨噬細胞和樹突狀細胞表面的TLR4可誘導(dǎo)促炎信號和抗炎信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別產(chǎn)生促炎因子TNF-α、IL-β和抗炎因子IL-10，來維持炎癥因子的平衡。那么，在糖尿病狀態(tài)下巨噬細胞介導(dǎo)的TLR4的激活是否改變了這種平衡狀態(tài)，導(dǎo)致DN的發(fā)生呢？目前還未見詳細報道。因此，本課題依據(jù)前期結(jié)果和文獻資料，在體外用高糖培養(yǎng)巨噬細胞，用TLR4的不同配體進行刺激，觀

3、察TLR4介導(dǎo)的促炎和抗炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達，探討高糖對巨噬細胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，明確巨噬細胞在DM和DN發(fā)生中的炎癥機制。
　　方法:
　　1、經(jīng)PMA活化的THP-1細胞同時用正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，再用LPS刺激，在0、2、4、8、16、24小時收集細胞。用Real-timePCR檢測炎癥因子IL-10、IL-1β、TNF-α mRNA的表達水平。
　　2、經(jīng)PMA活化的THP-1細胞同時用正

4、常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，再用LPS刺激，在0、2、4、8、16、24小時收集細胞上清;用HSP60刺激24h收集細胞上清用ELISA檢測炎癥因子IL-10、IL-1β、TNF-α的表達水平。
　　3、經(jīng)PMA活化的THP-1細胞同時用正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，再用LPS刺激，在0、15、30、60、120、180min收集細胞。另一組用LPS和HSP60刺激，在0、30、60、180min收集細胞，用Wes

5、ternblot檢測p110δ、P-NF-κB p65、NF-κB p65、P-AKT、AKT的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1、與空白對照組相比，IL-10mRNA正常組與高糖組在2h、4h時表達明顯增高，IL-1β mRNA正常組與高糖組在2h、4h、8h時表達明顯增高，TNF-αmRNA的正常組與高糖組在2h、4h、16h、24h時表達明顯增高。對照組IL-10mRNA表達量的高峰值出現(xiàn)在LPS刺激后的2小時，高糖組出現(xiàn)

6、在4小時，出現(xiàn)延遲現(xiàn)象。高糖組在4小時IL-1βmRNA表達量明顯高于正常組。高糖組在2小時TNF-α mRNA表達量顯著高于正常組。
　　2、上清ELISA結(jié)果，IL-10無明顯變化，LPS刺激時，IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生隨著時間延長均逐漸升高，且高糖組在任一時間點均高于正常組。LPS和HSP60同時刺激24h時，LPS刺激下IL-1β、TNF-α變化顯著，且高糖組高于正常組，HSP60刺激下變化不明顯。
　　3、We

7、stern blot結(jié)果顯示:LPS刺激細胞0、15、30、60、120、180min，P-NF-κB p6515分鐘時表達量增加，正常組60分鐘，高糖組15分鐘時時達到高峰，P-AKT60分鐘時表達增高，高糖組在同一時間點總體高于正常組;LPS和HSP60刺激細胞0、30、60、180min，高糖狀態(tài)下p110δ無論在LPS還是HSP60刺激下表達水平降低，P-NF-κB p65、P-AKT在LPS的作用下變化明顯。
　　結(jié)論: