CD147在肺腺、鱗癌及人肺腺癌細(xì)胞株A2中的表達(dá)及與其生物學(xué)行為相關(guān)性的研究.pdf

1、本文以人肺腺、鱗癌為研究對(duì)象，從蛋白和mRNA水平研究了CD147在肺腺、鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義；并進(jìn)一步研究了CD147與基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達(dá)的相關(guān)性，探討了CD147在肺腺、鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。本文還以人肺腺癌細(xì)胞株A2為研究對(duì)象，研究干擾CD147蛋自表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，進(jìn)而探討了CD147在肺癌細(xì)胞增殖中的作用。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、選取中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一

2、醫(yī)院胸外科2005年3月至12月55例肺癌手術(shù)患者，其中男34例，女21例，所有患者術(shù)前均未行放、化療等輔助治療，腫瘤均為單發(fā)。術(shù)后病理組織學(xué)分型依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年發(fā)布的非上皮性腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌31例，腺癌24例；術(shù)后病理分期根據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期28例，Ⅱ期9例，Ⅲ期18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例。取部分腫瘤組織及鄰近正常肺組織，立即放入液氮中，然后轉(zhuǎn)入．70℃冰箱中保存。

3、 2、人肺腺癌細(xì)胞株A2，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所第一研究室提供。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、免疫組化 標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水，3％H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物10min。微波修復(fù)抗原，95-96℃5min。正常山羊血清工作液封閉20min，傾去血清，加CD147一抗(1：50稀釋)(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。加生物素化二抗工作液(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司)室溫孵育20min。加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵

4、白素工作液(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司)室溫孵育20min，DAB顯色，反應(yīng)時(shí)間5min。蘇木素復(fù)染，脫水透明封片。用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。 陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：CD147染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色細(xì)顆粒狀，定位于癌細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中；MMP-2染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆粒，定位于癌細(xì)胞漿中。判定方法為在顯微鏡下觀察，根據(jù)棕色反應(yīng)的強(qiáng)度及面積判斷結(jié)果。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按Shimizu方法[9]：對(duì)每張切片陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性強(qiáng)度按淡黃色、棕黃色和褐色

5、分別為1、2、3分；著色陽(yáng)性面積按著色<1/3、1/3-2/3、>2/3分別為分1、2和3分。然后根據(jù)兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和判定其結(jié)果，分?jǐn)?shù)>3分為陽(yáng)性。 2、RT-PCR 切取少量癌組織及正常肺組織，RNAOUT試劑提取總RNA，行反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。 RNA引物合成：Medline數(shù)據(jù)庫(kù)中查找全基因序列，電腦軟件primer5.0版自行設(shè)計(jì)引物，并由北京三搏遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。 CD147(229bp)：

6、 上游引物：5’-GATACTCCTCACCTGCTCCTTG-3’ 下游引物：5’-CGACTTCACAGCCTTCACTCT-3’ β-actin(498bp)： 上游引物：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’ 下游引物：5’CTCCTTAATGTCACGCACGAITTC-3’ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，自動(dòng)成像系統(tǒng)照相，Band leader軟件分析各條帶m

7、RNA含量與β-actin mRNA含量的比值，計(jì)算相對(duì)量。 3、細(xì)胞培養(yǎng) 用含10％滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞成單層貼壁生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。 4、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)CD147siRNA轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞A2 人肺腺癌細(xì)胞株A2在RPIMl640完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×105接種于12孔板，分

8、四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即A2組、A2-脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組和A2-脂質(zhì)體-CD147 siRNA組；每組設(shè)3復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 5、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后24h到72h通過(guò)MTT法分別檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A2細(xì)胞，以2×105/ml的密度接種于96孔板，在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，無(wú)血清饑餓細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h，48h，72h后，分別加入MTT(5mg/ml

9、)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)490nm處的光密度值(A490)，繪制生長(zhǎng)曲線。 結(jié)論： 1、CD147在正常肺組織中不表達(dá)，而肺腺、鱗癌中表達(dá)明顯增高，且與肺腺癌、鱗癌組織學(xué)類型無(wú)關(guān)。 2、CD147的表達(dá)與肺腺、鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)及TNM分期正相關(guān)，推測(cè)CD147可能在肺腺、鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定作用。 3、MMP-2在肺腺、鱗癌組織中高表達(dá)，且CD147與MMP-2的表達(dá)正相關(guān)。 4、CD1