仙臺病毒N基因在昆蟲-桿狀病毒系統(tǒng)中的表達.pdf

1、仙臺病毒是人畜共患致病源之一。近年來，仙臺病毒對實驗動物和人的危害越來越為人們關注，檢測和預防仙臺病毒成為病毒研究者的重要任務之一。 利用病毒重要的抗原作為間接抗原診斷和免疫病毒宿主是預防病毒流行的重要方法?？乖嗍遣《揪幋a的自身結構蛋白，因此，本實驗依據仙臺病毒N基因抗原性與反應原性的特點，對N基因進行克隆，構建出昆蟲桿狀病毒N基因重組表達載體，表達出具有生物活性的重組蛋白，為檢測仙臺病毒和免疫動物提供基礎。 本研究先

2、在雞胚中傳代繁殖適量的仙臺病毒，提取純化后，以病毒基因組RNA做模版，經RT-PCR擴增仙臺病毒N基因，將其克隆至pMD18-T中命名pMD18-T-N并測序。測序基因經過PCR擴增被定向克隆至桿狀病毒穿梭載體pFastBac<'TM>HTb中，篩選正確重組質粒命名pFastBac<'TM>HTb-N。測序鑒定后，pFastBac<'TM>HTb-N轉化入含桿狀病毒感受態(tài)細菌DH10BAC，通過Ecoli自身較低概率的同源重組，藍白斑篩

3、選插入目的片段的桿狀病毒，命名rBacmid-N。rBacmid-N經過轉染生長狀態(tài)良好的昆蟲細胞，收毒接毒2-3代SDS-PAGE檢測蛋白表達條帶，表達的特異性條帶進行weston blot分析及與標準血清ELISA反應，確定所表達的重組N蛋白生物活性。 測序結果顯示，得到約1.6kb的N基因，該基因與其它仙臺病毒株核酸序列相比有一定的無義突變，但序列編碼肽鏈高度同源；提取重組病毒DNA，經PCR鑒定目的片段已經插入桿狀病毒基

4、因組中。rBacmid-N轉染sf9昆蟲細胞，昆蟲細胞病變明顯。SDS-PAGE電泳可見一條大小約60kD的特異性條帶，與預期一致。Western blot實驗結果顯示重組蛋白具有良好的抗原性。與標準血清ELISA反應結果表明N基因有較好的反應原性，適宜做間接抗原。 本實驗成功獲得仙臺病毒N基因，構建了N基因昆蟲桿狀病毒N重組表達載體，并在昆蟲細胞中表達了有生物活性的重組N蛋白，為利用N作間接抗原診斷仙臺病毒及其作為免疫抗原奠定