仙臺(tái)病毒N基因在昆蟲-桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá).pdf

1、仙臺(tái)病毒是人畜共患致病源之一。近年來，仙臺(tái)病毒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的危害越來越為人們關(guān)注，檢測(cè)和預(yù)防仙臺(tái)病毒成為病毒研究者的重要任務(wù)之一。 利用病毒重要的抗原作為間接抗原診斷和免疫病毒宿主是預(yù)防病毒流行的重要方法。抗原多是病毒編碼的自身結(jié)構(gòu)蛋白，因此，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)仙臺(tái)病毒N基因抗原性與反應(yīng)原性的特點(diǎn)，對(duì)N基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建出昆蟲桿狀病毒N基因重組表達(dá)載體，表達(dá)出具有生物活性的重組蛋白，為檢測(cè)仙臺(tái)病毒和免疫動(dòng)物提供基礎(chǔ)。 本研究先

2、在雞胚中傳代繁殖適量的仙臺(tái)病毒，提取純化后，以病毒基因組RNA做模版，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增仙臺(tái)病毒N基因，將其克隆至pMD18-T中命名pMD18-T-N并測(cè)序。測(cè)序基因經(jīng)過PCR擴(kuò)增被定向克隆至桿狀病毒穿梭載體pFastBac<'TM>HTb中，篩選正確重組質(zhì)粒命名pFastBac<'TM>HTb-N。測(cè)序鑒定后，pFastBac<'TM>HTb-N轉(zhuǎn)化入含桿狀病毒感受態(tài)細(xì)菌DH10BAC，通過Ecoli自身較低概率的同源重組，藍(lán)白斑篩

3、選插入目的片段的桿狀病毒，命名rBacmid-N。rBacmid-N經(jīng)過轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的昆蟲細(xì)胞，收毒接毒2-3代SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)條帶，表達(dá)的特異性條帶進(jìn)行weston blot分析及與標(biāo)準(zhǔn)血清ELISA反應(yīng)，確定所表達(dá)的重組N蛋白生物活性。 測(cè)序結(jié)果顯示，得到約1.6kb的N基因，該基因與其它仙臺(tái)病毒株核酸序列相比有一定的無義突變，但序列編碼肽鏈高度同源；提取重組病毒DNA，經(jīng)PCR鑒定目的片段已經(jīng)插入桿狀病毒基

4、因組中。rBacmid-N轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞病變明顯。SDS-PAGE電泳可見一條大小約60kD的特異性條帶，與預(yù)期一致。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白具有良好的抗原性。與標(biāo)準(zhǔn)血清ELISA反應(yīng)結(jié)果表明N基因有較好的反應(yīng)原性，適宜做間接抗原。 本實(shí)驗(yàn)成功獲得仙臺(tái)病毒N基因，構(gòu)建了N基因昆蟲桿狀病毒N重組表達(dá)載體，并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)了有生物活性的重組N蛋白，為利用N作間接抗原診斷仙臺(tái)病毒及其作為免疫抗原奠定