Bac-to-Bac桿狀病毒昆蟲表達系統(tǒng)介導重組腺相關病毒的制備.pdf

1、目的：通過桿狀病毒昆蟲表達系統(tǒng)，實現臨床級重組腺相關病毒(rAAV)的制備。
　　 方法：將腺相關病毒(AAV)載體pAAV-MCS的兩端反向重復序列(ITR)及目的基因表達框用限制性內切酶PciI和SfoI雙酶切，得到大小約2053bp的目的片段，過膠純化回收后用Klenow平端化處理。桿狀病毒載體pFastBacDual用限制性內切酶KpnI和HindⅢ雙酶切，過膠純化回收得到4806bp的目的片段，通過Klenow和T4P

2、olymerase平端化處理，用SolutionⅠ連接酶將兩個片段連接到一起，構建成6859bp大小的順式載體。經NdeI和HpaI雙酶切和EcoRI單酶切鑒定，及DNA測序無誤后命名為pBclAAV-MCS；為了檢測兩桿狀病毒昆蟲表達系統(tǒng)的可行性，設計正向引物EGFP-EcoRI-F和反向引物EGFP-Xbal-R經PCR反應從pIRES-EGFPk中增得到大小約720bp的EGFP基因片段，因為pBclAAV-MCS有同樣的酶切位點

3、EcoRI和XbaI，用SolutionⅠ連接酶將EGFP基因片段插入到pBclAAV-MCS的EcoRI和XbaI位點，經DNA測序正確后命名為pBclAAV-EGFP。反式載體是利用真核細胞基因表達調控的遺漏掃描(leaky scanning)原理，在幾個翻譯起始部位引入ACG或CTG，這樣一個啟動子可以同時啟動表達多個片段，將pAAV-MCS的衣殼蛋白(Capl)和復制蛋白(Rep2)經PCR反應分別克隆至桿狀病毒表達載體pFas

4、tBacDual的啟動子PP10和PPH下，命名為pBclAAVCap/Rep。分別將順式載體和反式載體轉化到DH10BacTM感受態(tài)中，制備成重組桿狀病毒顆粒Bacmid，經PCR鑒定正確后，分別命名為Bacmid AAV-EGFP和Bacmid AAV-Cap/Rep。按照Invitrogen質粒提取步驟提取Bacmid DNA后分別用轉染試劑脂質體CellfectinⅡ包裝，轉染sf9細胞制備P1病毒，然后用P1擴增P2病毒，使病

5、毒滴度達到約1012v.g./ml，用Bacmid AAV-EGFP和Bacmid AAV-Cap/Rep的P2病毒共感染昆蟲細胞sf9完成rAAV的拯救和包裝過程。最后rAAV感染293T細胞來檢測其活性。
　　 結果：順式載體由pAAV-MCS和pFastBacDual剪接嵌合而成，大小為6859bp，酶切鑒定及測序正確，命名為pBclAAV-MCS，將EGFP引入其多克隆位點，來檢測該系統(tǒng)的可行性，測序正確后命名為pBcl

6、AAV-EGFP；反式載體是利用真核基因遺漏掃描原理表達AAV的包裝元件，其中衣殼蛋白是南同一mRNA、不同起始密碼子和共同的終止子轉錄生產，復制蛋白包含Rep78和Rep52，起始密碼子分別是AUG和CUG，將衣殼蛋白和復制蛋白這兩個基因表達片段經PCR反應連接到相應的限制性內切酶位點，分別克隆到桿狀病毒載體pFastBacDual的啟動子PP1O下的KpnI和XhoI位點和PPH下的HindⅢ和BamHI位點，經DNA測序正確后命名

7、為pBclAAVCap/Rep。此后將順式載體和反式載體分別再轉化到DH10BacTM感受態(tài)細胞中，轉座形成桿粒Bacmid、在懸浮培養(yǎng)的昆蟲sf9細胞中制備成桿狀病毒，病毒滴度可達1-3x1012v.g./ml。然后用二桿狀病毒共感染sf9細胞，完成rAAV-EGFP的拯救、復制和包裝過程，經感染293T細胞測試具有良好的生物學活性。
　　 結論：該系統(tǒng)克服了常規(guī)rAAV制備的限制性因素，為臨床級基因治療用病毒的制備提供了實驗