SARS-3CL蛋白酶在桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的研究.pdf

1、【目的】昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(baculovirus expression vector system，BEVS)是當(dāng)今基因工程領(lǐng)域4大表達(dá)系統(tǒng)之一。SARS-3CL，蛋白酶是由SARS冠狀病毒編碼的一種蛋白水解酶，在SARS冠狀病毒的復(fù)制中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)旨在用Bac-to-Bac 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建3cl基因的重組表達(dá)載體，并預(yù)期在Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá) SARS-3CL蛋白酶，為篩選SARS-3CL蛋白酶的抑制劑奠

2、定基礎(chǔ)。 【方法】用酶切連接方法將3cl基因克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTB 中，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座載體pFB HTB-3CL，經(jīng)酶切鑒定陽(yáng)性的重組體轉(zhuǎn)化 DH10BacE.coli感受態(tài)細(xì)胞，兩次藍(lán)白斑初步篩選陽(yáng)性克隆，雙重PCR再次鑒定，抽提大分子質(zhì)粒DNA并純化，獲得含 SARS-3CL蛋白酶基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-HTB-3CL，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，待細(xì)胞病變后，收集重組桿狀病毒顆粒，

3、感染Sf9細(xì)胞，上清中病毒用PCR鑒定，收集的蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western Blot檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)預(yù)期表達(dá)的 SARS-3CL蛋白酶將為進(jìn)一步篩選 SARS-3CL 蛋白酶的抑制劑奠定工作基礎(chǔ)。 【結(jié)果】利用連接酶成功構(gòu)建了pFB HTB-3CL重組體，經(jīng)測(cè)序證明插入序列完全正確，重組體經(jīng)轉(zhuǎn)化 DH10Bac Ecoli感受態(tài)細(xì)胞，得到重組體 Bacmid-HTB-3CL，藍(lán)白斑篩選到白色克隆為陽(yáng)性克隆，經(jīng)雙

4、重PCR鑒定證明3CL蛋白酶基因成功轉(zhuǎn)座到桿狀病毒載體上，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)生明顯病變。得到大量的病毒，再次感染后，上清中病毒進(jìn)行PCR鑒定正確，但提蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及 Western Blot 檢測(cè)，沒(méi)有得到預(yù)期的蛋白條帶。 【結(jié)論】成功構(gòu)建了pFB HTB-3CL重組體，重組體轉(zhuǎn)化DH10Bac Ecoli感受態(tài)細(xì)胞，3CL蛋白酶基因成功轉(zhuǎn)座到桿狀病毒載體上，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效果明顯，但蛋