腦出血后基質金屬蛋白酶的表達變化及其在血腦屏障損害中的意義.pdf

1、研究背景:
　　 血腦屏障(Blood-brainbarrier，BBB)主要由腦血管內皮細胞與內皮細胞間緊密連接(Tightjunctions)構成，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內環(huán)境穩(wěn)定起決定性作用，其中緊密連接則是維持BBB功能的最關鍵的結構之一。緊密連接在結構上是由一組蛋白分子元件所構成的復合體，主要由跨膜蛋白claudins蛋白家族、junctionassociatedmolecules(JAMs)蛋白家族、occludin蛋白

2、及胞漿附屬蛋白zonulaoccludens(ZOs)蛋白家族構成。細胞膜上跨膜緊密連接蛋白分子彼此相互作用并與鄰近細胞膜上緊密連接蛋白相聚合，限制細胞旁物質轉運。生理條件下，BBB內皮細胞中這些緊密連接蛋白分子的表達受到嚴格的調控。當由于各種原因，如外傷、感染、缺血缺氧、高熱、腫瘤等，則可能通過多種途徑導致BBB內皮細胞緊密連接分子元件的表達、修飾、組裝異常進而直接導致BBB的結構、功能障礙。BBB的破壞是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病腦損害和疾病

3、發(fā)生、發(fā)展的重要原因。
　　 腦出血（Intracerebralhemorrhage，ICH）是一種常見的腦血管疾病，占腦卒中總發(fā)病率的15-20％，是最嚴重的腦卒中類型，死亡率、致殘率非常高。BBB的破壞是ICH發(fā)生后的一個普遍而重要的病理生理變化。目前認為，BBB破壞引起的血管源性腦水腫是ICH后腦水腫的主要類型。在ICH發(fā)生后，血腫周邊腦組織存在BBB緊密連接超微結構的破壞。目前，腦出血后緊密連接異常改變及血腦屏障破壞的具

4、體機制仍未完全清楚。而緊密連接是由一組不同的緊密連接蛋白分子所構成的復合體，因此闡明ICH后BBB內皮細胞各緊密連接蛋白分子的異常變化及其機制則是研究ICH等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中腦組織損傷機制的關鍵之一。
　　 在緊密連接蛋白表達變化的分子機制研究方面，隨著近年來緊密連接基礎研究的深入，目前認為，基質金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMPs)的表達與活性變化可能是導致細胞緊密連接蛋白分子元件異

5、常變化及BBB破壞的一個重要機制。MMPs是一類鋅離子依賴性蛋白酶，可降解細胞外所有基質成分，主要參與細胞間基質內細胞信號轉導、血管新生、炎癥反應、細胞增殖及遷移、胚胎發(fā)育及損傷修復過程。研究表明，腦出血患者及ICH大鼠模型上可檢測到MMPs表達增高，并且組織型基質金屬蛋白酶抑制劑-2可減輕ICH大鼠模型的BBB破壞。近年有研究報道，在大鼠局部腦缺血模型中，BBB主要緊密連接蛋白claudin-5、occludin的表達水平均明顯降低，

6、隨之出現(xiàn)大量的緊密連接蛋白降解產(chǎn)物。這一緊密連接蛋白的異常變化與組織中基質金屬蛋白酶-2、9(MMP-2、9)的表達水平與活性升高密切相關。當采用MMPs抑制劑BB-1101治療后，則可顯著抑制緊密連接蛋白claudin-5、occludin的破壞過程。
　　 因此，本研究推測:ICH發(fā)生后，血腫及血腫分解產(chǎn)物等物質可能通過多種途徑（尤其是MMPs通路）導致血腫周邊腦組織BBB緊密連接蛋白的表達與分布異常，進而產(chǎn)生BBB結構破壞

7、與腦水腫。
　　 目的:
　　 本研究通過采用腦內注射自體血制作大鼠ICH模型，檢測不同時間點血腫周邊腦組織MMP-2、9及相關BBB緊密連接蛋白claudin-5、occludin、JAM-1的表達變化，探究ICH后BBB緊密連接蛋白表達變化與BBB破壞的關系，并且進一步分析ICH后MMPs的表達與緊密連接蛋白表達改變的關系。
　　 實驗方法:
　　 1、實驗分組與ICH大鼠模型制作
　　 成年

8、雄性SpragueDawley大鼠128只，重量250～300g，隨機分為對照組和ICH6h、12h、24h、48h、3d、7d、14d等8個組別，每組16只。左心室采集自體血后，立體定向穿刺右側尾狀核，注射75μl非抗凝自體動脈血制作大鼠ICH模型。對照組采用正常大鼠。
　　 2、伊文思藍通透性
　　 大鼠處死前按4ml/kg劑量經(jīng)股靜脈注射2％伊文思藍生理鹽水溶液，取腦組織進行稱重，侵入2ml50％三氯乙酸水溶液中進

9、行勻漿，經(jīng)高速離心后與無水酒精按1:3混合，接著在熒光分光光度計上測量伊文思藍的熒光值，由標準曲線得到各腦組織伊文思藍濃度，以每克腦組織的伊文思藍含量(ug/g)來表示。
　　 3、石蠟組織包埋與切片
　　 各組大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，自左心室灌注冰凍生理鹽水及4％多聚甲醛溶液固定。切取厚度約2mm的尾狀核冠狀斷面腦組織，迅速投入4％多聚甲醛固定液中于4℃下固定2天。固定好的腦組織按照常規(guī)石蠟標本包埋方法進行制作石蠟標本，

10、石蠟組織切片機切片，切片厚度5um。
　　 4、HE染色
　　 石蠟切片脫蠟水合后，經(jīng)蘇木素染色3min，1％伊紅染色2min，中性樹膠封片、晾干后在顯微鏡下觀察、分析。
　　 5、免疫組化
　　 免疫組化檢測ICH后MMP-2及MMP-9表達變化。石蠟切片抗原修復采用微波爐抗原熱修復，抗原修復液為Tris-EDTA緩沖液(0.05MTris-base，0.001MEDTAPH8.0)，微波爐加熱至煮沸后

11、斷電，反復一次，間隔15min。DAB顯色，中性樹膠封片、晾干后在顯微鏡下觀察、分析。
　　 6、免疫熒光
　　 免疫熒光檢測各組緊密連接蛋白claudin-5、occludin、JAM-1的分布與表達的變化。用鼠抗claudin-5與兔抗GFAP聯(lián)合進行熒光雙標實驗及兔抗occludin、兔抗JAM-1進行免疫熒光單標實驗。用激光共聚焦顯微鏡在高倍視野下拍攝血腫周邊腦組織圖片，分析微小血管上緊密連接蛋白表達變化。

12、>　　 7、實時熒光定量PCR反應
　　 實時熒光定量PCR分析claudin-5、occludin、JAM-1表達變化。RNA提取純化使用GeneJETTMRNA純化試劑盒，逆轉錄合成cDNA采用Maxima(@)第一鏈cDNA合成試劑盒，具體步驟按照說明書操作。熒光定量PCR采用基于標準曲線的相對濃度定量的方法，SYBRGreen熒光方案檢測PCR擴增，使用ABIPRISM7500實時定量PCR儀進行分析。在熒光定量PCR

13、反應中取不同梯度模板DNA標準品生成標準曲線，各樣本的起始模板cDNA相對濃度由標準曲線上獲得，經(jīng)內參β-actin及對照組校準后以倍比表示。
　　 8、統(tǒng)計學方法
　　 應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，采用ONE-WAY方差分析。方差齊性時多重比較用LSD-t檢驗;方差不齊時用Welch近似方差分析，多重比較用DunnettT3檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。<

14、br>　　 實驗結果:
　　 1、各組腦組織伊文思藍含量結果提示:與正常對照組相比，ICH后24h至7d腦組織伊文思藍含量增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，其中ICH后48h增高最明顯，是正常對照組的2.23倍。
　　 2、通過HE染色觀察不同組別腦組織病理改變來看，ICH后6h及12h未見到血腫周圍區(qū)有明顯腦組織疏松化;ICH后24h時血腫周圍腦組織開始出現(xiàn)明顯的水腫帶;ICH48h:血腫周圍水腫嚴重廣泛，正常

15、的神經(jīng)細胞數(shù)目減少;ICH后3d血腫周圍不但可見到明顯的水腫帶，其顯著的特征是出現(xiàn)嚴重的炎癥反應，可觀察到大量白細胞滲出;ICH后7d可見血腫部分吸收，血腫周圍有不太明顯的水腫帶及大量吞噬細胞;ICH后14d血腫周邊水腫不明顯，血腫未完全吸收，吸收后的血腫區(qū)見較多吞噬細胞及含鐵血黃素沉積。
　　 3、免疫組化可觀察到ICH后MMP-2及MMP-9可見明顯增高。出血組自6h起血腫周圍腦組織可見強陽性表達MMP-2的細胞，其形態(tài)提示

16、為有突起的膠質細胞。ICH48h及3d血腫周邊MMP-2陽性細胞更顯著，可見血腫周圍小血管被MMP-2陽性細胞圍繞著，同時內皮細胞也表達不同程度的MMP-2。相應的，腦出血后MMP-9表達也明顯增高?？捎^察到出血組6h～24h血腫邊緣散在少數(shù)細胞陽性表達MMP-9，ICH后48h至7d可見到MMP-9表達明顯增高，主要分布在白細胞及內皮細胞上。
　　 4、ICH后緊密連接蛋白claudin-5表達明顯降低。共聚焦顯微鏡觀察提示c

17、laudin-5呈線條狀強烈表達于小血管上。與對照組比較，ICH組自6h起，claudin-5表達就出現(xiàn)降低，呈不連續(xù)及弱表達于內皮細胞間，48h及3d時其在血腫周圍腦水腫區(qū)域表達最低，7d時稍有恢復，直到14d基本恢復正常表達水平。相應的實時熒光定量PCR結果顯示，claudin-5mRNA表達在ICH后6h時出現(xiàn)迅速降低至最低水平，維持到7d逐漸恢復，直至14d仍低于正常水平，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 5

18、、ICH后緊密連接蛋白occludin表達明顯降低。共聚焦顯微鏡觀察提示occludin形態(tài)與claudin-5一致。ICH后6h起occludin呈不連續(xù)及弱表達于內皮細胞間，48h及3d時其在血腫周圍腦水腫區(qū)域表達最低，7d時逐漸恢復，于14d恢復至正常表達水平。相應的實時熒光定量PCR結果顯示，occludinmRNA表達在6h至3d表達降低，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 6、ICH后緊密連接蛋白JAM-1表

19、達先明顯降低，短期內迅速恢復后出現(xiàn)表達增高。共聚焦顯微鏡觀察提示，正常腦內皮上JAM-1形態(tài)與claudin-5、occludin一致。與對照組比較來看，ICH組自12h起，內皮細胞間JAM-1表達開始出現(xiàn)降低，呈不連續(xù)或及弱表達于內皮細胞間，24h、48h時其在血腫周圍腦水腫區(qū)域表達明顯降低。但與claudin-5及occludin不同的是，血管上JAM-1于3d時基本恢復正常，其表達較其他時間點更強烈，并表達在一些炎性細胞上。7d及

20、14d時血腫周圍可見大量表達JAM-1的炎性細胞。相應的實時熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比較，ICH后12h至48hJAM-1mRNA表達水平出現(xiàn)降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，3d時差異無統(tǒng)計學意義，ICH后7d其表達水平出現(xiàn)增高，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 結論:
　　 1、ICH后可導致BBB破壞及繼發(fā)性腦水腫發(fā)生，跨膜緊密連接蛋白claudin-5、occludin、JAM-1表