糖尿病及葡萄糖、血管緊張素Ⅱ、瘦素對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、自從1972年Rubler等提出糖尿病性心肌病變以來(lái)，人們對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，幾種可能的機(jī)制包括微血管病變、自主神經(jīng)功能失調(diào)、代謝功能紊亂、心肌間質(zhì)纖維化等，然而其確切的發(fā)病機(jī)制仍未完全弄清楚，多項(xiàng)研究表明心肌細(xì)胞凋亡參與缺血性心臟病、缺血再灌注損傷、心力衰竭、病毒性心肌炎等心臟病變的病理過(guò)程，并起重要作用。我們建立了成年SD大鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法，觀察了STZ糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞凋亡情況，并探討了在體外培養(yǎng)條件下葡萄糖

2、、血管緊張素II、瘦素對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病性心肌病變中的作用提供依據(jù)。 第一部分成年大鼠心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng) 分離和培養(yǎng)胚胎期或新生期動(dòng)物心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法較為成熟，已被廣泛運(yùn)用，而成年動(dòng)物的心肌細(xì)胞是處于分化終末期，細(xì)胞間通過(guò)閏盤和細(xì)胞外基質(zhì)彼此緊密連接，細(xì)胞個(gè)體大而脆弱，細(xì)胞邊界不清，易受缺血、缺氧、消化酶等因素的損傷，給分離和培養(yǎng)帶來(lái)困難。與成熟的心肌細(xì)胞相比，未成熟的心肌細(xì)胞無(wú)論在

3、功能還是在結(jié)構(gòu)等方面均存在差異，因此作為一種心血管研究領(lǐng)域的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工具，成熟心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型是無(wú)法替代的。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中采用主動(dòng)脈插管、聯(lián)合生物酶逆行灌流分離成年SD大鼠的心肌細(xì)胞，新分離的心肌細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀，比例為75～80％左右，表面橫紋明顯，非同步搏動(dòng)，細(xì)胞膜完整，部分細(xì)胞一端呈階梯狀，在含血清的培養(yǎng)環(huán)境中，4～8小時(shí)后，細(xì)胞開(kāi)始縮短、變圓，非同步搏動(dòng)明顯，部分細(xì)胞表面有大泡出現(xiàn)，24～48小時(shí)后，細(xì)胞搏動(dòng)減弱，橫紋消失，細(xì)

4、胞呈球狀或不規(guī)則形狀，逐漸有偽足伸出，部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁，3～4天后，細(xì)胞大部分貼壁，少部分細(xì)胞破碎、崩解；在無(wú)血清的培養(yǎng)環(huán)境中，心肌細(xì)胞大部分保持長(zhǎng)桿狀，橫紋一直存在，未見(jiàn)有偽足伸展，搏動(dòng)不明顯，僅見(jiàn)部分細(xì)胞頂端階梯狀結(jié)構(gòu)變圓鈍，二周后，兩種培養(yǎng)條件下的心肌細(xì)胞均大部分發(fā)生明顯萎縮。新分離的心肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白表達(dá)豐富，在有血清的培養(yǎng)環(huán)境中，48小時(shí)后，肌動(dòng)蛋白表達(dá)明顯減弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，采用聯(lián)合生物酶逆行灌流分離SD大鼠心肌細(xì)胞可獲得較

5、好質(zhì)量的心肌細(xì)胞，在體外培養(yǎng)的1～2周內(nèi)保持良好的活力，尤其在無(wú)血清的培養(yǎng)條件下，可保持在體特性，適合于進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要。 第二部分糖尿病、葡萄糖、瘦素、血管緊張素對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響. 既往有報(bào)道STZ糖尿病大鼠成模3天后心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中采用成模7天后的STZ糖尿病大鼠，分離心肌細(xì)胞，經(jīng)30分鐘體外培養(yǎng)后檢測(cè)其凋亡情況，并與對(duì)照組比較，結(jié)果顯示STZ糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增高(5．26±1．

6、296％V17．692±4．426％，P

7、．091％增至12．9±2．725％、15．482±2．921％(P

8、環(huán)境中的葡萄糖濃度，心肌細(xì)胞的凋亡率并無(wú)顯著意義的改變(4．935±2．001％V7．162±4．431％，P>O．05)；通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色的方法，在熒光顯微鏡下，心肌細(xì)胞周邊可見(jiàn)強(qiáng)綠色熒光，提示心肌細(xì)胞膜存在瘦素受體。這些結(jié)果提示：STZ糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞凋亡增高：在體外培養(yǎng)條件下，血管緊張素II、瘦素可促進(jìn)SD大鼠心肌細(xì)胞凋亡，并且與濃度有關(guān)，增加培養(yǎng)環(huán)境中的葡萄糖濃度，對(duì)SD大鼠心肌細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響，而瘦素可能通過(guò)與心肌