紅景天苷通過抑制NO通路減輕MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的神經(jīng)退化性疾病，PD的病理特點(diǎn)是黑質(zhì)、紋狀體多巴胺（Dopamine,DA）能神經(jīng)元的選擇性死亡、缺失，從而導(dǎo)致基底節(jié)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的紊亂。病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前較流行的假說(shuō)有遺傳、內(nèi)外環(huán)境毒素接觸、氧化應(yīng)激、線粒體功能異常、免疫因素、細(xì)胞凋亡等。
　　1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-te

2、t-rahydr-opyridine,MPTP）來(lái)源于人工合成毒品的中間產(chǎn)物，是一種能在多種動(dòng)物身上誘發(fā)類似帕金森病癥候群的神經(jīng)毒素,廣泛用于PD動(dòng)物模型的建立。MPTP本身對(duì)DA能神經(jīng)元沒有毒性,但在單胺氧化酶-B（MAO-B）的作用下形成的代謝物1-甲基-4苯基吡啶離子（1-methy-4-phenylpyridinium,MPP+），則具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。MPP+被DA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動(dòng)攝取到DA能神經(jīng)元胞體內(nèi)，選擇性損害DA能神經(jīng)元，

3、產(chǎn)生PD癥狀。同時(shí)MPP+還能夠使細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積，Ca2+平衡紊亂，一氧化氮(Nitric Oxide,NO)合成增加，這些因素均可加劇自由基的過度生成，降低細(xì)胞對(duì)自由基損傷的抵抗能力，最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性、死亡。
　　紅景天苷（Salidroside）是藏藥紅景天最有效的活性成分之一，具有廣泛的藥理學(xué)特性，如抗氧化、抗衰老、抗缺氧，抗癌等作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)紅景天苷具有很好的神經(jīng)元保護(hù)作用，有研究表明紅景天苷對(duì)谷氨酸和缺氧、低血

4、糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，還有報(bào)道指出紅景天苷對(duì)過氧化氫損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用，然而紅景天苷對(duì)MPP+損傷的DA神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用不清楚，本實(shí)驗(yàn)的目的是建立PD的細(xì)胞模型，觀察紅景天苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)的具有DA神經(jīng)元特性的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，并通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的NO、一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）、線粒體膜電位（Mitochondrial Membrane Potentia

5、l,MMP）、Ca2+等的變化來(lái)探討其具體保護(hù)機(jī)制。
　　1.研究目的與內(nèi)容
　　研究目標(biāo)：
　　建立MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的PD模型，通過測(cè)定一系列的生化指標(biāo)，探討紅景天苷的抗凋亡作用及其可能的機(jī)制，為PD的防治提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究?jī)?nèi)容：
　?。?）建立PD細(xì)胞凋亡模型。
　?。?）檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。
　?。?）篩選紅景天苷對(duì)抗MPP+的有效濃度。
　?。?）初步探討紅

6、景天苷發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制：NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1、以傳代培養(yǎng)的PC12細(xì)胞作為研究對(duì)象，并通過神經(jīng)毒素MPP+建立細(xì)胞凋亡模型，設(shè)立正常對(duì)照組、MPP+處理組、紅景天苷單獨(dú)處理組、紅景天苷（不同濃度）+MPP+處理組。
　　2.2、MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的存活率；Hoechst33258染色觀察細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。
　　2.3、NO的檢測(cè)，MMP的檢測(cè)、Ca

7、2+的檢測(cè)、ONOO-的檢測(cè)和NOS的檢測(cè)。
　　2.4、NOS抑制劑組（L-NMMA）+MPP+處理組，通過MTT觀察細(xì)胞存活率。
　　3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　3.1、PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度（100-600μMmol/L）的MPP+處理12、24、36和48小時(shí)后細(xì)胞存活率明顯下降，具有時(shí)間和劑量依賴性；時(shí)間越長(zhǎng),劑量越大，細(xì)胞存活率越低，當(dāng)500μmol/L的MPP+作用于PC12細(xì)胞24h,細(xì)胞活力為(53±1.5)％

8、,與正常對(duì)照組相比較P<0.05。故選定500μmol/L的MPP+作用于PC12細(xì)胞24h為陽(yáng)性對(duì)照組。
　　3.2、與MPP+組相比較,不同濃度的紅景天苷（10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）預(yù)處理可增加細(xì)胞存活率（P<0.05）;Hoechs33258染色細(xì)胞核濃縮明顯減少，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡的細(xì)胞明顯減少。
　　3.3、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常PC12細(xì)胞組相比較，MPP+處理組N

9、OS含量明顯增加，而經(jīng)紅景天苷預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)NOS相比較顯著降低。
　　3.4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MPP+處理組NO含量顯著增加，線粒體膜電位減少，鈣離子內(nèi)流增加，3-NT顯著減增加，而經(jīng)紅景天苷預(yù)處理后，NO含量顯著降低，MMP在一定程度內(nèi)恢復(fù)，鈣離子內(nèi)流減少，3-NT減少。
　　3.5、使用NOS抑制劑L-NMMA后，與MPP+處理組相比較，細(xì)胞存活力明顯增加。
　　4.小結(jié)
　　4.1、紅景天苷可劑量依賴