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文檔簡介
1、第一部分丙炔苯丙胺通過上調(diào)抗氧化蛋白NQO1表達(dá)保護(hù)1-甲基-4-苯基吡啶離子所致PC12細(xì)胞損傷
目的:本部分研究旨在帕金森?。≒D)的PC12細(xì)胞模型中證實(shí)丙炔苯丙胺的神經(jīng)保護(hù)作用,并對其保護(hù)機(jī)制進(jìn)行初步探索。
方法:應(yīng)用1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)處理PC12細(xì)胞制備PD的細(xì)胞模型。采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT 法)、細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放量檢測、活性氧蔟(ROS)含量檢測、四唑氮藍(lán)
2、/甘氨酸鹽法行醌結(jié)合蛋白檢測、Western Blots等方法檢測丙炔苯丙胺對MPP+所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,初步探索丙炔苯丙胺是否通過間接的抗氧化作用發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。
結(jié)果:MTT 法和LDH 釋放量檢測均顯示,不同濃度丙炔苯丙胺預(yù)處理可以顯著減輕MPP+導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷。ROS 含量測定以及四唑氮藍(lán)/甘氨酸鹽法醌蛋白濃度檢測的結(jié)果顯示,不同濃度丙炔苯丙胺預(yù)處理明顯地逆轉(zhuǎn)了MPP+導(dǎo)致的氧化應(yīng)激標(biāo)志物增高
3、。Western blots 檢測細(xì)胞內(nèi)輔酶Ⅰ醌類氧化還原酶1(NQO1)蛋白表達(dá)及二氯靛酚反應(yīng)法測定NQO1 活性的結(jié)果顯示,不同濃度的丙炔苯丙胺可以導(dǎo)致該抗氧化蛋白的表達(dá)量和酶活性均呈現(xiàn)出劑量依賴式的增高。另外,LDH 釋放量檢測結(jié)果顯示,雙香豆素抑制NQO1后,丙炔苯丙胺對細(xì)胞的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)了。
結(jié)論:丙炔苯丙胺可以通過上調(diào)抗氧化蛋白NQO1的表達(dá)和活性,減少氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志物的生成,發(fā)揮對MPP+所致的PC12細(xì)
4、胞損傷的保護(hù)作用。
第二部分丙炔苯丙胺通過促進(jìn)Nrf2 核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)PC12細(xì)胞抗氧化蛋白NQO1表達(dá)和活性增高
目的:驗(yàn)證丙炔苯丙胺是否通過促進(jìn)核因子紅系2 相關(guān)因子2(Nrf2)核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)PC12細(xì)胞抗氧化蛋白NQO1表達(dá)和酶活性增高。
方法:應(yīng)用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取PC12細(xì)胞的胞漿胞核蛋白,再采用Western blots 技術(shù)檢測胞漿胞核中Nrf2的蛋白含量變化;采用
5、Nrf2 小分子干擾RNA(SiRNA)轉(zhuǎn)染技術(shù),進(jìn)一步驗(yàn)證Nrf2在丙炔苯丙胺誘導(dǎo)NQO1 酶活性上調(diào)過程中的作用。
結(jié)果:Western blots 結(jié)果表明,在MPP+的單獨(dú)處理下,PC12細(xì)胞胞漿和胞核的Nrf2 含量都出現(xiàn)了減少。而丙炔苯丙胺預(yù)處理可以有效地減少胞漿內(nèi)的Nrf2 含量,增加核內(nèi)Nrf2的含量,且其胞漿內(nèi)Nrf2的相對表達(dá)水平比MPP+單獨(dú)處理時(shí)還要低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在轉(zhuǎn)染了Nrf2 SiRN
6、A的PC12細(xì)胞中,NQO1的活性出現(xiàn)了明顯降低。另外,在Nrf2基因被沉默后,丙炔苯丙胺所導(dǎo)致的NQO1 酶活性上調(diào)也消失了。
結(jié)論:丙炔苯丙胺所導(dǎo)致的抗氧化蛋白NQO1 酶活性增強(qiáng)是通過促進(jìn)Nrf2 核轉(zhuǎn)位,從而驅(qū)動(dòng)NQO1 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)這一途徑完成的。
第三部分 Akt和Erk 信號通路在丙炔苯丙胺抗氧化應(yīng)激介導(dǎo)的PC12細(xì)胞保護(hù)機(jī)制中的作用
目的:本部分研究旨在探索丙炔苯丙胺促進(jìn)Nrf2 核
7、轉(zhuǎn)位的上游激酶調(diào)控通路,并觀察丙炔苯丙胺對B 型單胺氧化酶(MAOB)的抑制作用是否也參與了Nrf2的激活過程。
方法:應(yīng)用Western Blots 方法檢測PC12細(xì)胞中Akt和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk)等激酶的磷酸化水平變化,并應(yīng)用各種激酶抑制劑處理PC12細(xì)胞觀察各個(gè)激酶對Nrf2和NQO1的調(diào)控作用。另外,我們應(yīng)用MAOB和Nrf2 SiRNA 轉(zhuǎn)染,來分析丙炔苯丙胺對MAOB 抑制作用是否影響了Nrf2 介導(dǎo)
8、的抗氧化反應(yīng)。
結(jié)果:經(jīng)過Western blots 法檢測發(fā)現(xiàn),丙炔苯丙胺處理PC12細(xì)胞可以誘導(dǎo)Akt和Erk的磷酸化水平呈時(shí)間依賴性增高。另外,丙炔苯丙胺介導(dǎo)的Nrf2 核轉(zhuǎn)位和NQO1表達(dá)增高被可以被PD98059 部分阻斷,而PI3K的抑制劑LY294002 幾乎完全地取消了丙炔苯丙胺導(dǎo)致的Nrf2 核轉(zhuǎn)位和NQO1表達(dá)增高。對SiRNA 轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞的ROS測定表明,MAOB基因沉默可以使ROS 含量出現(xiàn)
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