附子多糖對缺氧-復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)及其線粒體機(jī)制探討.pdf

1、研究背景：
　　心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是現(xiàn)在臨床上常見的一種病理生理現(xiàn)象，它是由缺血的心肌在恢復(fù)血流后引起的，表現(xiàn)為組織損傷反而更加重，甚至產(chǎn)生不可逆性的損傷。MIRI限制了對缺血心肌的許多重要治療手段如冠狀動脈搭橋術(shù)、急性心肌梗死溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)等的開展，已成為臨床上亟待解決的問題。大量資料表明，細(xì)胞凋亡是MIRI后心肌細(xì)胞死亡

2、的主要形式。然而，關(guān)于MIRI導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的研究仍大部分集中在凋亡現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及某些嘗試性的干預(yù)措施，對于凋亡的分子機(jī)制尚不十分清楚。隨著研究的深入，線粒體在MIRI導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡過程中的調(diào)控作用逐漸被揭示，這被認(rèn)為是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的重大進(jìn)展之一。近年的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激信號后，能夠引起第二個線粒體來源的胱氨酸酶激活劑/低等電點(diǎn) IAP直接結(jié)合蛋白(second mitochondria-derived activato

3、r of caspase/direct IAP-binding protein with low PI，Smac/Diablo)從線粒體釋放入胞漿，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。中藥附子作為我國傳統(tǒng)名方如四逆湯、參附湯的君藥，在對MIRI的研究中表現(xiàn)出良好的抗心肌細(xì)胞凋亡作用[1-6]。如今，中藥單體的研究成為熱點(diǎn)，附子多糖(fuzi polysaccharide，F(xiàn)PS)作為從附子中提取出的區(qū)別于烏頭堿的另一類單體，因其具有降糖調(diào)脂、增強(qiáng)免

4、疫力和協(xié)助抗腫瘤等藥理活性，正逐漸受到人們的關(guān)注，然而，關(guān)于其對MIRI的心肌保護(hù)作用及機(jī)制的研究卻未見報道。
　　研究目的：
　　本研究通過建立新生大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷模型來模擬體內(nèi)MIRI，通過給予FPS來觀察其對心肌的保護(hù)作用，并以細(xì)胞凋亡的線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為著眼點(diǎn)，進(jìn)一步探討FPS在MIRI中的保護(hù)機(jī)制，為FPS的藥物開發(fā)和利用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)室

5、依據(jù)。
　　研究方法：
　　原代體外分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠的心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對照（Control）組、缺氧/復(fù)氧（H/R）組（缺氧3 h后復(fù)氧6 h）和附子多糖（FPS）組（預(yù)先以不同濃度0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的FPS干預(yù)培養(yǎng)24 h，然后與H/R組作相同處理），處理結(jié)束后進(jìn)行：
　　1、心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:用倒置顯微鏡觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)的改變，分析缺氧/復(fù)氧和不同

6、濃度附子多糖對心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。
　　2、心肌細(xì)胞活力測定:用四唑鹽MTT比色法檢測各組心肌細(xì)胞的存活率，判斷附子多糖對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)。
　　3、心肌細(xì)胞LDH的漏出量和CK活力的檢測:通過測定各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性以及細(xì)胞內(nèi)肌酸激酶（creatine kinase，CK）的活力，反映細(xì)胞膜和線粒體膜受損的情況，分析FPS對氧化應(yīng)激過程中細(xì)胞膜

7、通透性改變的影響。
　　4、心肌細(xì)胞 MDA含量以及 SOD活力的測定:分別檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活力，判斷FPS對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及抗氧化酶合成的影響。
　　5、心肌細(xì)胞 MT含量的檢測:通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白(metallothionein，MT)的含量，反映心

8、肌細(xì)胞對氧自由基的清除能力，分析附子多糖對心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的作用。
　　6、心肌細(xì)胞凋亡率的測定:采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞的凋亡率，判斷附子多糖對心肌缺氧/復(fù)氧引發(fā)的細(xì)胞凋亡的影響。
　　7、心肌細(xì)胞胞漿中Smac/Diablo蛋白含量的檢測:用Western Blot的方法檢測各組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)由線粒體釋放的Smac/Diablo蛋白含量，反映線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeabili

9、ty transition pore，mPTP）的開放程度，探討FPS對細(xì)胞凋亡的線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。
　　8、心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bcl-xl mRNA和Bcl-xs mRNA基因水平的測定:用熒光定量PCR檢測FPS對各組心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bcl-xl mRNA和Bcl-xs mRNA基因調(diào)控的影響，從基因水平上探討其在心肌保護(hù)中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、附子多糖對缺氧/復(fù)氧乳鼠

10、心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響:Control組心肌細(xì)胞生長良好，形態(tài)呈多樣化（圓形、錐形或梭形），成簇搏動的細(xì)胞增多，細(xì)胞簇搏動規(guī)律有力，胞漿呈枝芽狀突起并向細(xì)胞簇周圍呈放射狀生長。缺氧/復(fù)氧后，細(xì)胞搏動減弱甚至消失，胞漿突起縮短甚至消失，大量死細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)基中。FPS可以改善心肌細(xì)胞的形態(tài)，減少漂浮的死細(xì)胞數(shù)量，10 mg/mL時細(xì)胞形態(tài)較清晰。
　　2、附子多糖對心肌細(xì)胞活力的影響:H/R組心肌細(xì)胞存活率明顯降低，與 Control

11、組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。FPS可以隨著濃度增加提高心肌細(xì)胞的存活率，從0.1 mg/mL開始與H/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　3、附子多糖對LDH和CK滲漏的影響:細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性以及心肌細(xì)胞內(nèi)CK的活力H/R組均顯著增高，與Control組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。20 mg/mL以下時，F(xiàn)PS能夠隨著濃度增加降低培養(yǎng)液中LDH的活性，從1 mg/mL起與H/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

12、（P<0.05）。FPS也可以降低心肌細(xì)胞內(nèi)CK的活力，但只有10 mg/mL時與H/R組比較才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　4、附子多糖對MDA含量和SOD活力的影響:H/R組心肌細(xì)胞MDA含量明顯增加，與Control組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。20 mg/mL以下時，F(xiàn)PS能隨著濃度增大而減少心肌細(xì)胞內(nèi)MDA的含量，從1 mg/mL開始與H/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。H/R組細(xì)胞內(nèi)SOD活力顯

13、著下降，與Control組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。FPS可以使各組心肌細(xì)胞SOD的活力升高，但是只有10 mg/mL與H/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　5、附子多糖對心肌細(xì)胞內(nèi)MT含量的影響:H/R組心肌細(xì)胞的MT含量比Control組明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。1 mg/mL開始FPS組的MT含量進(jìn)一步增加，與H/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），其中10 mg/mL組MT的含量最

14、高。
　　6、附子多糖對心肌細(xì)胞凋亡率的影響:H/R組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，與 Control組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。20 mg/mL以下時，F(xiàn)PS濃度越高，心肌細(xì)胞的凋亡率越低，1 mg/mL起與H/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　7、附子多糖對胞漿中Smac/Diablo蛋白含量的影響:H/R組與Control組比較，胞漿中Smac/Diablo蛋白的含量顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.0

15、1）。FPS可以減少Smac/Diablo蛋白含量，在20 mg/mL以下呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，從1 mg/mL開始與H/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　8、附子多糖對 Bcl-2 mRNA、Bcl-xl mRNA和Bcl-xs mRNA基因調(diào)控的作用:H/R組Bcl-2 mRNA和Bcl-xl mRNA基因的表達(dá)與Control組相比較均明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。20 mg/mL以下時，F(xiàn)PS可呈現(xiàn)劑量

16、依賴地促進(jìn)Bcl-2 mRNA和Bcl-xl mRNA基因的表達(dá)，并分別于0.1 mg/mL和1 mg/mL開始與H/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；H/R后，Bcl-xs mRNA表達(dá)較Control組增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。FPS能從1 mg/mL起降低Bcl-xs mRNA的表達(dá)，在10 mg/mL時Bcl-xs mRNA的表達(dá)量最低，與H/R比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　結(jié)論：