四君子湯 柴疏四君湯 柴胡疏肝散作用于脾虛證大鼠模型的生物效應(yīng)比較.pdf

1、“方證相關(guān)”是中醫(yī)辨證論治和方劑學(xué)中的重要邏輯命題。方劑的功用不僅與方藥配伍有關(guān)，還與其所作用的證之間具有一定的適配性，即方劑效用大小在相當(dāng)程度上取決于所作用對(duì)象的病機(jī)與其方藥配伍關(guān)系之間的針對(duì)性，方與證之間存在有關(guān)聯(lián)程度大小的問(wèn)題。但到目前為止，還沒(méi)有人能從實(shí)證意義上為“方證相關(guān)”提供系統(tǒng)的科學(xué)證據(jù)。基于上述背景，本文以在內(nèi)涵上具有一定關(guān)聯(lián)的方劑和證候?yàn)榍腥朦c(diǎn)，運(yùn)用關(guān)聯(lián)排他和異方同證的研究方法較為系統(tǒng)地探查了中醫(yī)“方證相關(guān)”命題的客觀

2、真實(shí)性。 本研究首先依據(jù)中醫(yī)關(guān)于脾虛證的病因病機(jī)學(xué)說(shuō)、臨床表現(xiàn)和其涉及到現(xiàn)代相關(guān)疾病的病理生理的變化特點(diǎn)，采用復(fù)合病因造模法復(fù)制脾虛證大鼠模型，通過(guò)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)中的多指標(biāo)觀察，以獲得模型的中醫(yī)證候及部分生物學(xué)特點(diǎn)；在此基礎(chǔ)上，比較觀察具有健脾、疏肝和疏肝健脾功用的四君子湯、柴胡疏肝散和柴疏四君湯三方對(duì)該模型的作用異同，探討同一脾虛證條件下三方效用的差異，以獲得三方與脾虛證之間可能存在的關(guān)聯(lián)性及其關(guān)聯(lián)性現(xiàn)代內(nèi)涵。之后，觀

3、察了四君子湯對(duì)脾虛證模型甲狀腺軸、血液流變學(xué)、能量代謝等其它方面的效應(yīng)，了解方證相應(yīng)條件下的四君子湯的作用效應(yīng)譜其可能涉及到的生物學(xué)基礎(chǔ)。最后，運(yùn)用基因芯片技術(shù)探查了脾虛證模型及四君子湯對(duì)模型作用的全基因表達(dá)，進(jìn)一步分析探討脾虛模型和四君子湯作用的分子機(jī)制。 全文分為文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究?jī)纱蟛糠?。文獻(xiàn)綜述部分主要對(duì)脾虛證動(dòng)物模型復(fù)制研究進(jìn)展及存在問(wèn)題、四君子湯的實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用、基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的研究與應(yīng)用現(xiàn)況等三個(gè)方

4、面進(jìn)行綜述。實(shí)驗(yàn)研究部分主要包括脾虛證大鼠模型的復(fù)制及評(píng)價(jià)；四君子湯、柴胡疏肝散及柴疏四君湯對(duì)脾虛模型的影響；四君子湯對(duì)模型中甲狀腺軸、能量代謝、血液流變學(xué)的調(diào)節(jié)作用；脾虛證大鼠模型相關(guān)基因表達(dá)譜及四君子湯對(duì)其影響的初步探查四方面。 研究一 脾虛證大鼠模型的建立 方法：將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和脾虛模型組，每組40只。模型組大鼠采用過(guò)度勞倦加飲食失節(jié)的方法。模型大鼠每日下午2：00置于盛有溫水的塑料鋼化桶中游泳10min：隔

5、日喂食(隔同禁食，隔同足量給食)，連續(xù)3w。于造模第22d開(kāi)始，停止上述造模因素，自然飼養(yǎng)條件下觀察1w。分別于造模的第1、2、3、4w取材，用間苯三酚法測(cè)尿D-木糖排泄率，用高效液相色譜一電化學(xué)法檢測(cè)單胺神經(jīng)遞質(zhì)，用試劑盒放免法檢測(cè)血清GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、TNFα；血漿MTL、SS、VIP、NPY、SP、β-EP、ACTH、CORT：下丘腦CRH的含量。 結(jié)論：該模型大鼠表現(xiàn)出部分類(lèi)似脾虛證的癥狀，存在小腸

6、吸收功能障礙、胃腸功能、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)遞質(zhì)、HPA軸功能的紊亂。結(jié)果提示本模型符合中醫(yī)脾虛證的表現(xiàn)，且存在胃腸功能紊亂和神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)中多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)障礙。 研究二 四君子湯、柴疏四君湯和柴胡疏肝散對(duì)脾虛證大鼠模型的作用 方法：將大鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(20只)，模型組(50只)，模型組大鼠按上述制模方法處理3w，于造模第3w木分別從對(duì)照組和模型組隨機(jī)各取大鼠10只取材。第22d停止造模，模型組大鼠隨機(jī)分成脾虛模

7、型(model)、柴胡疏肝散(CHSGS)，四君子湯(SJZT)、柴疏四君湯(CSSJT)四組，每組10只。中藥三組分別按1mL/100g體重給予柴胡疏肝散、四君子湯、柴疏四君湯灌胃，連續(xù)7d，每日1次。模型組和對(duì)照組分別給予等量蒸餾水。4w末剖殺取材，用上述方法測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，并用MTT法測(cè)定脾T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化功能。 結(jié)論：脾虛模型大鼠表現(xiàn)有胃腸功能、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)遞質(zhì)、HPA軸等方面的異常變化；被觀察的三方均具有不同程度的調(diào)

8、節(jié)作用，其中四君子湯能明顯降低模型大鼠血漿MTL、海馬DA；升高模型大鼠血清GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、TNFα、海馬5-HT、NE、血漿SS、VIP、ACTH、CORT及脾T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化功能。柴胡疏肝散能明顯降低模型大鼠血漿VIP、血清IL-2、海馬DA及脾T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化功能；能明顯升高模型大鼠海馬NE、血漿CORT。柴疏四君湯能明顯升高模型大鼠血清GAS、IL-1β、血漿SS、ACTH、CORT、海馬NE；能明顯

9、降低模型大鼠海馬DA及脾T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化功能。結(jié)果提示，四君子湯在調(diào)節(jié)脾虛模型胃腸功能、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)異常改變方面優(yōu)于柴胡疏肝散、柴疏四君湯：較之于柴胡疏肝散和柴疏四君湯二方，四君子湯與中醫(yī)脾虛證之間具有更大的關(guān)聯(lián)性。 研究三 四君子湯對(duì)脾虛證大鼠模型的其他作用 方法：將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(20只)和模型組(30只)。模型組按上述方法制模，于造模第3w末分別從對(duì)照組和模型組隨機(jī)各取大鼠10只取材，第4w停止造模

10、，模型組大 鼠隨機(jī)分成脾虛模型組(model)、四君子湯(SJZT)兩組，每組各10只。四君子湯組按1mL/100g體重給予灌胃，連續(xù)7d，每日1次。脾虛模型組和對(duì)照組分別給予等量蒸餾水。于4w末剖殺取材，放免法檢測(cè)血清TSH、T<,3>、T<,1>和血漿TXB<,2>、6-keto-PGF<,1α>；高效液相法檢測(cè)肝組織能荷；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清LDL、CK、P-AMY；比色法檢測(cè)肝組織Na<'+>-K<'+>-ATPas

11、e、Ca<'2+>-Mg<'2+>-ATPase、Ca<'2+>-ATPase；血液粘度測(cè)試儀測(cè)定血流變。 結(jié)論：脾虛證模型存在甲狀腺功能、能量代謝、血液流變學(xué)及TXB<,2>/6-Keto-PGF<,1a>的異常改變；四君子湯可明顯升高脾虛模型組大鼠血清TSH、T<,3>、T<,4>、LDH、肝組織EC、Ca<'2+>-Mg<'2+>-ATPase、Ca<'+>-ATPase活力及TXB<,2>/6-keto-PGF<,1a>

12、，明顯降低模型大鼠血清P-AMY、肝組織AMP、全血粘度、還原粘度、血漿TXB<,2>、6-keto-PGF<,1a>。結(jié)果表明，四君子對(duì)脾虛模型大鼠出現(xiàn)的甲狀腺功能、酶學(xué)、血液流變學(xué)異常具有一定的調(diào)節(jié)作用。 研究四 脾虛證大鼠模型相關(guān)基因表達(dá)及四君子湯對(duì)其的影響 方法：將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(20只)和模型組(30只)。模型組按上述方法制模，于造模第3w術(shù)分別從對(duì)照組和模型組隨機(jī)各取大鼠10只在無(wú)菌條件下取脾臟。第4w停

13、止造模，造模組動(dòng)物隨機(jī)分成脾虛模型(model)、四君子湯(SJZT)兩組，每組各10只。四君子湯組按1mL/100g體重給予四君子湯灌胃，連續(xù)7d，每日1次。模型組和對(duì)照組分別給予等量蒸餾水。同前法于第4w術(shù)在無(wú)菌條件下剖取脾臟，進(jìn)行脾臟RNA的提取、樣品RNA熒光標(biāo)記、雜交與清洗、芯片掃描、圖像采集與數(shù)據(jù)分析；主要利用 http：//www．biorag．org/中的功能基因庫(kù)對(duì)獲得的差異基因進(jìn)行功能查詢。 結(jié)論：脾

14、虛證模型存在部分基因的異常表達(dá)，涉及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶催化活性、能量代謝、蛋白質(zhì)合成等多個(gè)方面；四君子湯對(duì)脾虛的基因表達(dá)具有廣泛作用，其中涉及到對(duì)MAPK信號(hào)通路、甘油磷脂代謝、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)系統(tǒng)、JAK-STAT信號(hào)通路等多個(gè)方面。結(jié)果提示，多個(gè)基因的異常表達(dá)可能是中醫(yī)脾虛證的分子基礎(chǔ)，而脾虛證治方則對(duì)包括與脾虛證相關(guān)的基因在內(nèi)的多個(gè)基因發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。 綜上，采用游泳勞倦和飲食失節(jié)復(fù)合法復(fù)制出的脾虛證模

15、型，表現(xiàn)出少動(dòng)、乏力、食欲減退、消瘦、大便稀溏等脾虛證的類(lèi)似癥狀，伴有胃腸功能、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫、血液流變學(xué)、能量代謝等多系統(tǒng)的功能紊亂，并存在部分基因的異常表達(dá)。結(jié)果提示，中醫(yī)脾虛證可能是一個(gè)以多組基因表達(dá)異常為基礎(chǔ)、涉及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)中多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)障礙的綜合征。四君子湯、柴胡疏肝散和柴疏四君湯三方對(duì)脾虛證模型的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫方面有一定的調(diào)節(jié)作用，其中四君子湯對(duì)脾虛模型胃腸激素、免疫因子、神經(jīng)遞質(zhì)方面均有很好的調(diào)節(jié)作用；柴

16、胡疏肝散對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)有調(diào)節(jié)作用，能使降低的VIP、IL-2、脾T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化功能再度降低；柴疏四君湯主要對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)、HPA軸有調(diào)節(jié)作用。四君子湯在調(diào)節(jié)脾虛模型神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫、胃腸功能方面明顯優(yōu)于柴胡疏肝散和柴疏四君湯。對(duì)三方治療效應(yīng)譜和作用強(qiáng)度的綜合評(píng)價(jià)表明，四君子湯對(duì)脾虛模型的療效最好，柴疏四君湯次之，柴胡疏肝散較差，四君子湯與脾虛證的關(guān)聯(lián)性最大。四君子湯還對(duì)模型中存在的甲狀腺功能、血液流變學(xué)、能量代謝等方面的異常有一定的改善作