理中丸和四君子湯與脾虛證方證相關性的實驗研究.pdf

1、辨證論治體系的研究對中醫(yī)學發(fā)展至關重要，這一體系的兩個中心環(huán)節(jié)是證候與復方。方劑是辨證論治指導下對證候治療的具體體現(xiàn)。所以，對方證相關性關系的研究，能夠促進中醫(yī)理論在中藥復方配伍中的重要性和科學性的闡明，為中醫(yī)理論指導中藥治療證提供現(xiàn)代生物學依據(jù)。 研究中醫(yī)藥理論上必然會遇到大量的信息分析，充分利用生物信息學方法，可以有針對性地獲得更有價值的的數(shù)據(jù)。聚類分析(clusteranalysis)，與回歸分析、判別分析一起被稱為多元分

2、析的三大方法，是將隨機現(xiàn)象歸類的統(tǒng)計學方法，已廣泛應用于醫(yī)學科學研究之中。這種方法尤其適用于對傳統(tǒng)中醫(yī)理論的驗證，可以通過客觀的數(shù)理統(tǒng)計得到的結果來判斷傳統(tǒng)理論的客觀性，確定統(tǒng)計分析結果中的“方”與“證”還是否相關。 脾胃為后天之本，“四季脾旺不受邪”，脾胃氣虛，百病由生。可見脾虛證在疾病發(fā)生過程中占有重要位置。脾虛證主要包括脾氣虛證和脾陽虛證。脾氣虛證和脾陽虛證既有相似之處，又有其各自特點。所以，選用這兩個證，更能體現(xiàn)出方證相

3、關性的獨特之處。與脾氣虛證和脾陽虛證相對應，本項目選用臨床治療脾陽虛證和脾氣虛證效果明顯的經典方—理中丸和四君子湯作為代表方。 利血平塑造脾虛證模型是較經典的方法之一。利血平屬于外周交感神經阻滯藥，可以使體內兒茶酚胺類物質耗竭，使交感神經功能低下，副交感神經功能相對亢進；同時，又引起腹瀉而耗氣。模型出現(xiàn)的各種虛弱癥狀與臨床脾虛癥狀十分相似，且具有條件易控制、模型較穩(wěn)定之特點。雖然單純利血平脾虛大鼠的氣虛或陽虛證證候特征不夠明確，

4、但正是在這一單純脾虛證的共同背景下，更能顯示出針對不同證候的不同方劑作用的異同，體現(xiàn)出方證相關的獨特性。 所以，本實驗擬以脾虛證作為方證相關性研究的對象，采用利血平脾虛證動物模型，通過研究四君子湯和理中丸對脾虛證模型的影響，采用聚類分析的多元統(tǒng)計分析方法，對各指標進行分析，探討理中丸和四君子湯與脾虛證的方證相關性。 方法選用SD大鼠，腹腔注射利血平造成大鼠脾虛模型，選用理中丸和四君子湯作為治療藥物，并分高、低劑量組，選用

5、阿托品作為陽性對照藥，并設自然恢復組與治療組相對比。 對動物進行大體觀察和空腸的光鏡和電鏡的觀察以及動物基礎活動度的觀測。記錄血凝時間。放免法測定血清中胃泌素、IL-1、IL-6含量；空腸中P物質(SP)、血管活性腸肽(VIP)含量；MTT法測定脾淋巴細胞增殖；ELISA法測定血清中IFN-γ和TNF-α含量；微量全血法測定外周血及PP結中T淋巴細胞亞群。對動物小腸PP結進行計數(shù)，ABC染色法測定空腸TNF-α和TGF-β表達。

6、 在SPSS12.0和SAS8.0統(tǒng)計分析軟件上進行數(shù)據(jù)分析。采用方差分析對數(shù)據(jù)結果進行了分析，選取有顯著差異度的指標和樣本，進行聚類分析。 結果1大體觀察SD大鼠，腹腔注射利血平造成大鼠脾虛模型后，相繼出現(xiàn)糊狀稀便，食欲下降，體重下降，倦怠、懶動，喜聚堆等脾虛癥狀。經理中丸、四君子湯和阿托品治療后，癥狀均有一定程度的改善。 2基礎活動度模型組動物自主活動度較正常組顯著降低。與模型組比較，各理高組，四高組和阿托品

7、組大鼠的自主活動次數(shù)有顯著性增高，理低組和自然恢復不能有效改善動物自主活動的狀況。 3凝血時間模型組的凝血時間顯著高于正常組，阿托品組凝血時間顯著低于模型組，理中丸組和四君子湯組不能有效改善利血平脾虛證動物的凝血機制。 4光鏡觀察正常組：粘膜絨毛排列整齊，腺體清晰可見，結構正常，被覆上皮完整，其間可見少量杯狀細胞。固有層無改變。腸腔干凈。 模型組：絨毛排列紊亂，數(shù)量減少，長短、寬窄不一，被覆上皮可見有多量杯狀細胞

8、，腸腔內可見多量剝脫、退變、壞死的絨毛碎片。粘膜下層可見少量散在淋巴細胞浸潤，肌層無巨變，腺體有處萎縮。 各治療組：絨毛排列較模型組整齊，但仍可見長短、寬窄不一，杯狀細胞比模型組明顯減少，絨毛上段及頂端可見組織壞死及剝脫。壞死組織內見有炎細胞浸潤，腸腔內可見剝脫、壞死的絨毛組織。 自然恢復組：絨毛粗細不一，可見少量的絨毛萎縮及大量杯狀細胞，被覆上皮有處剝脫，肌層較中藥組明顯萎縮。 5電鏡觀察：正常組：可見大小不等

9、的指狀突起的絨毛，絨毛扁平，排列整齊，表面完整，絨毛問有明顯間隔，絨毛表面有大量突起清晰可見。 模型組：絨毛叢倒伏糜爛，破損明顯，呈不規(guī)則形狀，絨毛間隔消失，絨毛表面突起減少，不易分辨。 治療組及恢復組：可見各治療組及恢復組小腸絨毛及微絨毛有不同程度的恢復，尤以陽性藥物組最為顯著。鏡下可見絨毛指狀突起排列較為整齊，表面比較完整，可見絨毛間隔有所恢復，絨毛表面突起增多 6血清中胃泌素含量脾虛模型組中胃泌素含量較正常

10、組顯著升高。理中丸組的胃泌素含量均較模型組顯著降低，而與正常組沒有顯著性差異。阿托品組和自然恢復組的血清胃泌素含量較模型組沒有顯著性差異。四君子湯低劑量組的胃泌素含量較模型組顯著降低，而與正常組沒有顯著性差異；而四君子湯高劑無顯著性作用. 7空腸中SP、VIP含量正常對照組比較，模型組大鼠空腸段VIP含量明顯降低，SP含量明顯增高。與模型組比較，理中丸和四君子湯組大鼠空腸段VIP含量均明顯增高，但差異不具有顯著性。理中丸和四君子

11、湯高劑量組大鼠空腸段SP含量明顯降低，理中丸和四君子湯低劑量組沒有顯著改變。自然恢復組的動物雖然有所恢復，但沒有完全恢復到正常組的狀態(tài)，兩者之間存在顯著性差異，阿托品組亦可以有效改善VIP和SP的含量。 8脾淋巴細胞增殖模型組對ConA誘導的脾細胞增殖反應能力較正常組明顯降低，治療組中，理中丸低劑量組和四君子湯高劑量組和阿托品組的T淋巴細胞增殖功能顯著增高，而四君子湯低劑量組對T淋巴細胞增殖功能無顯著作用，自然恢復組的T淋巴細胞

12、增殖功能雖比模型組降低，但與正常組相比仍有顯著性差異。 對于LPS，各組問無顯著性差異。 9血清中細胞因子含量脾虛模型組大鼠IFN-γ、TNF-α、IL-1比正常對照組顯著下降；理中丸和四君子湯高低劑量組、阿托品組能明顯升高IFN-γ含量，而自然恢復組雖然能在一定程度上升高，但與模型組比較沒有顯著性差異。 脾虛模型組大鼠IL-6含量比正常對照組顯著升高；理中丸和四君子湯高低劑量組、阿托品組能明顯降低IL-6含量，

13、自然恢復組血清中IL-6無顯著性改變。10外周血T細胞亞群 利血平造模后大鼠外周血中T淋巴細胞亞群出現(xiàn)CD4下降，CD8上升，CD4/CD8比值下降，而理中丸治療后雖不能顯著影響CD4和CD8各自數(shù)量，但可以顯著升高CD4/CD8比例，使之趨于正常。阿托品組也有同樣的效果，但自然恢復組的T淋巴細胞亞群比例雖然有所恢復，但與正常對照組還有顯著差異。四君子湯治療后不能顯著影響CD4數(shù)量，可以顯著降低CD8的數(shù)量，從而顯著升高CD4/

14、CD8比例，使之趨于正常。 11小腸PP結計數(shù)：各組問PP結數(shù)量無顯著性差異。 12PP結中T淋巴細胞亞群的檢測 利血平造模后大鼠的PP結中的T淋巴細胞亞群變化顯著無統(tǒng)計學意義。治療組和正常組及模型組之間也無顯著差異。 13空腸中細胞因子的表達(TGF-β和TNF-α)利血平造模后大鼠的空腸中TGF-β的表達較正常組降低，而理中丸低劑量組和高劑量組以及阿托品組的TGF-β表達較脾虛組升高，但與正常組亦有顯

15、著差異。四君子湯高劑量組空腸內TGF-β表達較脾虛組顯著升高，但與正常組亦有顯著差異。陽性藥物和自然恢復組的TGF-β表達較脾虛組無顯著差異，顯著降低于正常組。 利血平造模后大鼠的空腸中TNF-α的表達較正常組升高，而理中丸和四君子湯高、低劑量組、阿托品組及自然恢復組的TNF-α表達較脾虛組顯著降低。 14理中丸和四君子湯與脾虛證的相關性分析從樣本上看，正常組、模型組及各治療組有較好的區(qū)分度；從指標上看，脾T淋巴細胞增殖

16、、空腸中TGF-β表達、外周血CD4+T淋巴細胞亞群、外周血T淋巴細胞亞群CD4/CD8比值、血清中IFN-γ和IL-1含量、空腸中VIP含量、體重、外周血CD8+T淋巴細胞亞群、空腸中SP含量、血清中IL-6含量和血清中胃泌素含量等指標在正常組和模型組有較好的區(qū)分度；血清中IL-6、脾T淋巴細胞增殖、空腸中TGF-β表達、血清胃泌素、外周血中CD4+/CD8+T淋巴細胞亞群的比值在理中丸組和四君子湯組有較好區(qū)分度。 結論·理中

17、丸和四君子湯可以減輕利血平所致脾虛癥狀； ·理中丸和四君子湯對利血平脾虛大鼠凝血時間無顯著影響； ·理中丸和四君子湯可以改善利血平脾虛大鼠腸道病理及超微結構，降低血清中胃泌素的含量，調節(jié)機體消化功能； ·理中丸和四君子湯可以通過升高VIP，降低SP，對利血平所致脾虛大鼠的神經內分泌網絡有一定調節(jié)作用； ·理中丸和四君子湯可以通過升高脾T淋巴細胞增殖功能；升高血清中IFN-γ，TNF-α，IL-1，降低IL