理中丸和四君子湯與脾虛證方證相關(guān)性的實驗研究.pdf

1、辨證論治體系的研究對中醫(yī)學(xué)發(fā)展至關(guān)重要，這一體系的兩個中心環(huán)節(jié)是證候與復(fù)方。方劑是辨證論治指導(dǎo)下對證候治療的具體體現(xiàn)。所以，對方證相關(guān)性關(guān)系的研究，能夠促進(jìn)中醫(yī)理論在中藥復(fù)方配伍中的重要性和科學(xué)性的闡明，為中醫(yī)理論指導(dǎo)中藥治療證提供現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)。 研究中醫(yī)藥理論上必然會遇到大量的信息分析，充分利用生物信息學(xué)方法，可以有針對性地獲得更有價值的的數(shù)據(jù)。聚類分析(clusteranalysis)，與回歸分析、判別分析一起被稱為多元分

2、析的三大方法，是將隨機現(xiàn)象歸類的統(tǒng)計學(xué)方法，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)科學(xué)研究之中。這種方法尤其適用于對傳統(tǒng)中醫(yī)理論的驗證，可以通過客觀的數(shù)理統(tǒng)計得到的結(jié)果來判斷傳統(tǒng)理論的客觀性，確定統(tǒng)計分析結(jié)果中的“方”與“證”還是否相關(guān)。 脾胃為后天之本，“四季脾旺不受邪”，脾胃氣虛，百病由生?？梢娖⑻撟C在疾病發(fā)生過程中占有重要位置。脾虛證主要包括脾氣虛證和脾陽虛證。脾氣虛證和脾陽虛證既有相似之處，又有其各自特點。所以，選用這兩個證，更能體現(xiàn)出方證相

3、關(guān)性的獨特之處。與脾氣虛證和脾陽虛證相對應(yīng)，本項目選用臨床治療脾陽虛證和脾氣虛證效果明顯的經(jīng)典方—理中丸和四君子湯作為代表方。 利血平塑造脾虛證模型是較經(jīng)典的方法之一。利血平屬于外周交感神經(jīng)阻滯藥，可以使體內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)耗竭，使交感神經(jīng)功能低下，副交感神經(jīng)功能相對亢進(jìn)；同時，又引起腹瀉而耗氣。模型出現(xiàn)的各種虛弱癥狀與臨床脾虛癥狀十分相似，且具有條件易控制、模型較穩(wěn)定之特點。雖然單純利血平脾虛大鼠的氣虛或陽虛證證候特征不夠明確，

4、但正是在這一單純脾虛證的共同背景下，更能顯示出針對不同證候的不同方劑作用的異同，體現(xiàn)出方證相關(guān)的獨特性。 所以，本實驗擬以脾虛證作為方證相關(guān)性研究的對象，采用利血平脾虛證動物模型，通過研究四君子湯和理中丸對脾虛證模型的影響，采用聚類分析的多元統(tǒng)計分析方法，對各指標(biāo)進(jìn)行分析，探討理中丸和四君子湯與脾虛證的方證相關(guān)性。 方法選用SD大鼠，腹腔注射利血平造成大鼠脾虛模型，選用理中丸和四君子湯作為治療藥物，并分高、低劑量組，選用

5、阿托品作為陽性對照藥，并設(shè)自然恢復(fù)組與治療組相對比。 對動物進(jìn)行大體觀察和空腸的光鏡和電鏡的觀察以及動物基礎(chǔ)活動度的觀測。記錄血凝時間。放免法測定血清中胃泌素、IL-1、IL-6含量；空腸中P物質(zhì)(SP)、血管活性腸肽(VIP)含量；MTT法測定脾淋巴細(xì)胞增殖；ELISA法測定血清中IFN-γ和TNF-α含量；微量全血法測定外周血及PP結(jié)中T淋巴細(xì)胞亞群。對動物小腸PP結(jié)進(jìn)行計數(shù)，ABC染色法測定空腸TNF-α和TGF-β表達(dá)。

6、 在SPSS12.0和SAS8.0統(tǒng)計分析軟件上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用方差分析對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行了分析，選取有顯著差異度的指標(biāo)和樣本，進(jìn)行聚類分析。 結(jié)果1大體觀察SD大鼠，腹腔注射利血平造成大鼠脾虛模型后，相繼出現(xiàn)糊狀稀便，食欲下降，體重下降，倦怠、懶動，喜聚堆等脾虛癥狀。經(jīng)理中丸、四君子湯和阿托品治療后，癥狀均有一定程度的改善。 2基礎(chǔ)活動度模型組動物自主活動度較正常組顯著降低。與模型組比較，各理高組，四高組和阿托品

7、組大鼠的自主活動次數(shù)有顯著性增高，理低組和自然恢復(fù)不能有效改善動物自主活動的狀況。 3凝血時間模型組的凝血時間顯著高于正常組，阿托品組凝血時間顯著低于模型組，理中丸組和四君子湯組不能有效改善利血平脾虛證動物的凝血機制。 4光鏡觀察正常組：粘膜絨毛排列整齊，腺體清晰可見，結(jié)構(gòu)正常，被覆上皮完整，其間可見少量杯狀細(xì)胞。固有層無改變。腸腔干凈。 模型組：絨毛排列紊亂，數(shù)量減少，長短、寬窄不一，被覆上皮可見有多量杯狀細(xì)胞

8、，腸腔內(nèi)可見多量剝脫、退變、壞死的絨毛碎片。粘膜下層可見少量散在淋巴細(xì)胞浸潤，肌層無巨變，腺體有處萎縮。 各治療組：絨毛排列較模型組整齊，但仍可見長短、寬窄不一，杯狀細(xì)胞比模型組明顯減少，絨毛上段及頂端可見組織壞死及剝脫。壞死組織內(nèi)見有炎細(xì)胞浸潤，腸腔內(nèi)可見剝脫、壞死的絨毛組織。 自然恢復(fù)組：絨毛粗細(xì)不一，可見少量的絨毛萎縮及大量杯狀細(xì)胞，被覆上皮有處剝脫，肌層較中藥組明顯萎縮。 5電鏡觀察：正常組：可見大小不等

9、的指狀突起的絨毛，絨毛扁平，排列整齊，表面完整，絨毛問有明顯間隔，絨毛表面有大量突起清晰可見。 模型組：絨毛叢倒伏糜爛，破損明顯，呈不規(guī)則形狀，絨毛間隔消失，絨毛表面突起減少，不易分辨。 治療組及恢復(fù)組：可見各治療組及恢復(fù)組小腸絨毛及微絨毛有不同程度的恢復(fù)，尤以陽性藥物組最為顯著。鏡下可見絨毛指狀突起排列較為整齊，表面比較完整，可見絨毛間隔有所恢復(fù)，絨毛表面突起增多 6血清中胃泌素含量脾虛模型組中胃泌素含量較正常

10、組顯著升高。理中丸組的胃泌素含量均較模型組顯著降低，而與正常組沒有顯著性差異。阿托品組和自然恢復(fù)組的血清胃泌素含量較模型組沒有顯著性差異。四君子湯低劑量組的胃泌素含量較模型組顯著降低，而與正常組沒有顯著性差異；而四君子湯高劑無顯著性作用. 7空腸中SP、VIP含量正常對照組比較，模型組大鼠空腸段VIP含量明顯降低，SP含量明顯增高。與模型組比較，理中丸和四君子湯組大鼠空腸段VIP含量均明顯增高，但差異不具有顯著性。理中丸和四君子

11、湯高劑量組大鼠空腸段SP含量明顯降低，理中丸和四君子湯低劑量組沒有顯著改變。自然恢復(fù)組的動物雖然有所恢復(fù)，但沒有完全恢復(fù)到正常組的狀態(tài)，兩者之間存在顯著性差異，阿托品組亦可以有效改善VIP和SP的含量。 8脾淋巴細(xì)胞增殖模型組對ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)能力較正常組明顯降低，治療組中，理中丸低劑量組和四君子湯高劑量組和阿托品組的T淋巴細(xì)胞增殖功能顯著增高，而四君子湯低劑量組對T淋巴細(xì)胞增殖功能無顯著作用，自然恢復(fù)組的T淋巴細(xì)胞

12、增殖功能雖比模型組降低，但與正常組相比仍有顯著性差異。 對于LPS，各組問無顯著性差異。 9血清中細(xì)胞因子含量脾虛模型組大鼠IFN-γ、TNF-α、IL-1比正常對照組顯著下降；理中丸和四君子湯高低劑量組、阿托品組能明顯升高IFN-γ含量，而自然恢復(fù)組雖然能在一定程度上升高，但與模型組比較沒有顯著性差異。 脾虛模型組大鼠IL-6含量比正常對照組顯著升高；理中丸和四君子湯高低劑量組、阿托品組能明顯降低IL-6含量，

13、自然恢復(fù)組血清中IL-6無顯著性改變。10外周血T細(xì)胞亞群 利血平造模后大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群出現(xiàn)CD4下降，CD8上升，CD4/CD8比值下降，而理中丸治療后雖不能顯著影響CD4和CD8各自數(shù)量，但可以顯著升高CD4/CD8比例，使之趨于正常。阿托品組也有同樣的效果，但自然恢復(fù)組的T淋巴細(xì)胞亞群比例雖然有所恢復(fù)，但與正常對照組還有顯著差異。四君子湯治療后不能顯著影響CD4數(shù)量，可以顯著降低CD8的數(shù)量，從而顯著升高CD4/

14、CD8比例，使之趨于正常。 11小腸PP結(jié)計數(shù)：各組問PP結(jié)數(shù)量無顯著性差異。 12PP結(jié)中T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 利血平造模后大鼠的PP結(jié)中的T淋巴細(xì)胞亞群變化顯著無統(tǒng)計學(xué)意義。治療組和正常組及模型組之間也無顯著差異。 13空腸中細(xì)胞因子的表達(dá)(TGF-β和TNF-α)利血平造模后大鼠的空腸中TGF-β的表達(dá)較正常組降低，而理中丸低劑量組和高劑量組以及阿托品組的TGF-β表達(dá)較脾虛組升高，但與正常組亦有顯

15、著差異。四君子湯高劑量組空腸內(nèi)TGF-β表達(dá)較脾虛組顯著升高，但與正常組亦有顯著差異。陽性藥物和自然恢復(fù)組的TGF-β表達(dá)較脾虛組無顯著差異，顯著降低于正常組。 利血平造模后大鼠的空腸中TNF-α的表達(dá)較正常組升高，而理中丸和四君子湯高、低劑量組、阿托品組及自然恢復(fù)組的TNF-α表達(dá)較脾虛組顯著降低。 14理中丸和四君子湯與脾虛證的相關(guān)性分析從樣本上看，正常組、模型組及各治療組有較好的區(qū)分度；從指標(biāo)上看，脾T淋巴細(xì)胞增殖

16、、空腸中TGF-β表達(dá)、外周血CD4+T淋巴細(xì)胞亞群、外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4/CD8比值、血清中IFN-γ和IL-1含量、空腸中VIP含量、體重、外周血CD8+T淋巴細(xì)胞亞群、空腸中SP含量、血清中IL-6含量和血清中胃泌素含量等指標(biāo)在正常組和模型組有較好的區(qū)分度；血清中IL-6、脾T淋巴細(xì)胞增殖、空腸中TGF-β表達(dá)、血清胃泌素、外周血中CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比值在理中丸組和四君子湯組有較好區(qū)分度。 結(jié)論·理中

17、丸和四君子湯可以減輕利血平所致脾虛癥狀； ·理中丸和四君子湯對利血平脾虛大鼠凝血時間無顯著影響； ·理中丸和四君子湯可以改善利血平脾虛大鼠腸道病理及超微結(jié)構(gòu)，降低血清中胃泌素的含量，調(diào)節(jié)機體消化功能； ·理中丸和四君子湯可以通過升高VIP，降低SP，對利血平所致脾虛大鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)有一定調(diào)節(jié)作用； ·理中丸和四君子湯可以通過升高脾T淋巴細(xì)胞增殖功能；升高血清中IFN-γ，TNF-α，IL-1，降低IL