骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2-注射式硫酸鈣緩釋載體與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外生物相容性研究.pdf

1、骨組織工程在解決臨床骨缺損這一棘手問題上具有許多優(yōu)勢,是近年來研究的熱點。良好的支架材料和生長因子對細胞的粘附,增殖、分化具有決定性作用。然而生長因子存在穩(wěn)定性差、半衰期短等不足,限制了其臨床應用,利用載體或緩釋系統(tǒng)負載生長因子,既能保護生長因子的生物活性,又可以使生長因子緩慢釋放,從而持續(xù)促進細胞生長及組織修復再生,因而控釋載體材料的應用是目前組織工程研究的熱點。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bonemorphogeneticprotein-2

2、,BMP-2)能誘導和加速MSCs向成骨樣細胞分化。注射式硫酸鈣(InjectableCalciumSulfateCement,ICSC)是醫(yī)用半水硫酸鈣的衍生產(chǎn)品之一,可以作為支架材料搭載糖蛋白,氨基苷類抗生素。因此本實驗應用骨組織工程學方法,將BMP-2負載于ICSC上,制備BMP-2緩釋載體,探討其緩釋性能以及對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖,分化的影響。旨在通過體外實驗為BMP-2尋找較理想的緩釋載體,為臨床修復骨缺損提供一種微創(chuàng)治療

3、方式。
　　 第一部分骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/注射式硫酸鈣緩釋載體對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外成骨誘導的影響
　　 目的:研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BoneMorphogeneticProtein-2,BMP-2)/注射式硫酸鈣(InjectableCalciumSulfateCement,ICSC)復合載體對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MarrowMesenchymalStemCells,MSCs)的體外誘導成骨的影響。
　　

4、 材料和方法:頸椎脫臼處死SD大鼠,無菌條件下取其股骨、脛骨,用含體積分數(shù)10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,沖出骨髓,淋巴細胞分離液分離后,常規(guī)傳代培養(yǎng)。取第三代生長狀態(tài)良好的細胞,應用免疫細胞化學法測定骨髓間充質(zhì)干細胞表型。種植于兩種載體體外復合培養(yǎng)。實驗分三組:實驗組A:單純BMP-2;實驗組B:BMP-2/ICSC;C組:空白對照組。通過檢測緩釋載體上種植細胞后不同時間點(3,7,10,14d)載體上細胞數(shù),堿性磷酸

5、酶活性,同時應用堿性磷酸酶,茜素紅及馮庫薩染色對復合培養(yǎng)的細胞進行成骨細胞表型鑒定。
　　 結(jié)果:第三代MSCs經(jīng)復合培養(yǎng)7d后,實驗組A,B兩組堿性磷酸酶染色為陽性,對照組陰性;三組載體中細胞數(shù)量均隨培養(yǎng)時間延長而增長,實驗組B的細胞數(shù)增加最快,與相同時間點其他各組材料中細胞數(shù)差異有顯著性(P＜0.05);各時間點細胞堿性磷酸酶活性表達實驗組B最高,對照組最低,差異亦有顯著性(P＜0.05);實驗A,B馮庫薩,茜素紅染色均為陽

6、性,C組陰性。
　　 結(jié)論:MSCs在BMP-2/ICSC載體上培養(yǎng)后可具有成骨細胞特性。該載體能誘導MSCs向成骨細胞分化,能夠保留BMP-2的生物活性,可以作為較理想的生長因子載體應用于骨組織工程。
　　 第二部分骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/注射式硫酸鈣緩釋載體與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外生物相容性
　　 目的:觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/注射式硫酸鈣緩釋系統(tǒng)的體外緩釋效果及與種子細胞的生物相容性。
　　 材料和

7、方法:大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)體外誘導培養(yǎng)、擴增后種植于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/注射式硫酸鈣緩釋載體和單純的注射式硫酸鈣行體外培養(yǎng)。測定緩釋支架材料上骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的釋放量和持續(xù)時間;種植細胞后細胞的黏附率;培養(yǎng)3,7,10,14d時支架材料中細胞數(shù)、堿性磷酸酶活性,7d行堿性磷酸酶染色,14d行茜素紅染色和馮庫薩染色,并在掃描電鏡下觀察載體上細胞生長情況。實驗分兩組:實驗組:BMP-2/ICSC;對照組:ICSC。體外用磷酸鹽緩沖溶液(

8、PhosphateBufferedSolution,PBS)浸泡支架,應用酶聯(lián)免疫吸附試劑測定方法(EnzymeLinkedImmuno-SorbentAssay,ELISA)檢測實驗組不同時間點緩釋液內(nèi)的BMP-2含量,繪制釋放曲線,確定釋放時間,評價載體緩釋性能。
　　 結(jié)果:該緩釋支架具有一定的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2緩釋效果,持續(xù)時間可達31d。第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)成骨誘導培養(yǎng),可表達成骨細胞表型,實驗組堿性磷酸酶細胞