pEGFP-N-,2--VEGF基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與PLGA材料相容性.pdf

1、目的：探討轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-VEGF（攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的血管內(nèi)皮生長因子基因）后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與PLGA（聚乳酸/乙醇酸共聚物）材料的相容性。 方法：1、原代培養(yǎng)以密度梯度離心法獲得兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，常規(guī)換液、傳代、凍存與復(fù)蘇，流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞周期；2、將含pEGFP-N2-VEGF基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌種搖菌過夜，以無內(nèi)毒素大提試劑盒提取質(zhì)粒，用紫外分光光度法及瓊脂糖電泳檢測其濃度及純度；3、用脂質(zhì)體包埋法將

2、pEGFP-N2-VEGF基因轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，免疫組織化學(xué)觀察是否有蛋白表達(dá)；4、同法轉(zhuǎn)染接種于PLGA種植模型上的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別利用熒光顯微鏡及掃描電鏡進(jìn)行觀察；5、MTT（四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)）檢測轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-VEGF前后細(xì)胞活力，分4組：①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、②轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-VEGF骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、③骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+PLGA組、④轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-VEGF骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+P

3、LGA組。 結(jié)果：1、原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈細(xì)長梭形，克隆樣生長；多次傳代后出現(xiàn)老化現(xiàn)象，細(xì)胞變扁平。流式細(xì)胞術(shù)示第二代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞90％以上的細(xì)胞都處于G0/G1期。而第六代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞G0/G1期約占80％左右。2、紫外分光光度法示搖菌后獲得的pEGFP-N2-VEGF質(zhì)粒溶度為1380μg/ml，瓊脂糖電泳可見相應(yīng)條帶；3、pEGFP-N2-VEGF基因轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，PT-PCR檢測可有特征性的擴(kuò)增條帶

4、出現(xiàn)，與DNAmark相比較，條帶位置相符；48h后行細(xì)胞免疫化學(xué)染色，VEGF抗體反應(yīng)呈陽性。4、轉(zhuǎn)基因后可以在熒光顯微鏡、掃描電鏡下較好的觀察細(xì)胞與材料之問的相互作用；5、MTT示轉(zhuǎn)染前后4組各孔光吸收值在492nm波長時(shí)分別為：0.309±0.113、0.350±0.176、0.295±0.112、0.336±0.172；在629nm波長時(shí)依次為0.104±0.036、0.121±0.050、0.085±0.035、0.102±0

5、.053，①組與②組、③組與④組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。 結(jié)論：1、密度梯度離心法可獲得足夠數(shù)量較強(qiáng)分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-VEGF基因后可在分子和蛋白層次獲得表達(dá)；3、轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-VEGF基因可作為標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一種有效方式，為動(dòng)態(tài)脫察細(xì)胞與材料之間的相互作用打下了一定的基礎(chǔ)；4、轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-VEGF基因不影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PLGA