藍(lán)細(xì)菌融合標(biāo)簽技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)方法的建立與優(yōu)化.pdf

1、隨著基因工程與合成生物學(xué)的發(fā)展，光合藍(lán)細(xì)菌利用光能與CO2分別作為唯一的能源和碳源，已經(jīng)可以合成生產(chǎn)多種生物能源與精細(xì)化學(xué)品，但是目前藍(lán)細(xì)菌相關(guān)生物合成代謝途徑的關(guān)鍵酶的研究信息不足嚴(yán)重限制了其應(yīng)用潛力，藍(lán)細(xì)菌的生產(chǎn)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他模式工程菌。為了解決這個問題，需要對藍(lán)細(xì)菌生理代謝有更為深入的了解，而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)需要完成對細(xì)胞內(nèi)重要功能蛋白質(zhì)以及蛋白復(fù)合體的準(zhǔn)確分析和定位。最近廣泛應(yīng)用于分離純化蛋白質(zhì)的融合標(biāo)簽技術(shù)為我們建立藍(lán)細(xì)菌中蛋白

2、質(zhì)的分離純化方法提供了一種思路，但分離純化蛋白質(zhì)常常受到細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)量的限制，尤其是藍(lán)細(xì)菌中存在豐富的由類囊體膜、細(xì)胞膜以及外膜組成的生物膜系統(tǒng)，而且許多膜蛋白的表達(dá)量非常低，這給我們分離純化其蛋白質(zhì)帶來了更大的困難，因此融合標(biāo)簽技術(shù)應(yīng)用于藍(lán)細(xì)菌中分離純化蛋白質(zhì)需要進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。
　　為了建立藍(lán)細(xì)菌中蛋白質(zhì)的分離純化方法，本文以模式藍(lán)細(xì)菌集胞藻 PCC6803作為研究對象，選取其細(xì)胞中的膜蛋白Δ-6與Δ-9脂肪酸去飽和酶作

3、為待分離純化的目的蛋白質(zhì)，利用融合PCR技術(shù)與同源重組雙交換的方法，構(gòu)建了在目的蛋白質(zhì)C端分別插入His標(biāo)簽或者3×FLAG標(biāo)簽的突變株。利用融合標(biāo)簽的親和純化作用，我們成功分離得到了Δ-6與Δ-9脂肪酸去飽和酶，同時在比較His標(biāo)簽和3×FLAG標(biāo)簽的靈敏性，使用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)確定目的蛋白質(zhì)表達(dá)量較高的時間點(diǎn)，利用超速離心法與非離子型去垢劑釋放結(jié)合于膜上的目的蛋白質(zhì)，以及放大培養(yǎng)集胞藻PCC6803以提高獲得生物量幾個方面對分