含P301L突變的tau轉基因小鼠的傳代建系及其UPS研究.pdf

1、細胞內的神經元纖維纏結(NFTs)是老年性癡呆(AD)的兩個典型病理改變之一，NTFs的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關蛋白Tau。本實驗室研究的終目標是建立含P301L突變的tau轉基因小鼠模型，研究Tau在AD等神經退行性疾病發(fā)病機制中的作用，探索tau與胞內蛋白降解重要通路——泛素—蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的關系，開發(fā)和篩選以Tau為靶點的治療藥物。 本實驗室的前期研究，是將帶有小鼠特異性的神經元啟動子Thy-1和人的含P

2、301L突變tau基因，通過雄原核顯微注射法構建轉基因小鼠并傳至第四代。檢測轉基因陽性小鼠腦內有外源性tau的表達；海馬及皮層部位具有NFTs的改變；并且具備行為學改變的趨勢，但樣本數太少。 本課題是在以上實驗的基礎上，繼續(xù)探討含P301L突變的tau轉基因鼠的行為學改變及傳代建系；并在轉基因鼠上研究UPS。還在SH—SY5Y細胞株上研究煙堿和膽堿受體拮抗藥對泛素的影響。 Morris水迷宮結果顯示，3月齡轉基因陽性鼠

3、開始出現行為學改變趨勢，6月齡陽性鼠的逃逸潛伏期明顯長于陰性鼠，在第2、4、5天具有統(tǒng)計學差異；9、12月齡陽性鼠的逃逸潛伏期在第2、3、4、5天均長于陰性鼠，具有統(tǒng)計學差異。空間搜索實驗中，6、9、12、15月齡陽性鼠的平臺穿越次數均多于陰性鼠，具有統(tǒng)計學差異。結果表明，含P301L突變的tau轉基因小鼠具有學習記憶障礙。 傳代結果顯示，種內繁殖群F1～F5代的攜帶外源性基因的陽性率(％)分別為48.33、45.31、64.1

4、、69.86、63.16，而種間繁殖群F1～F5代的陽性率(％)分別為50、51.35、77.94、87.91、86.36，兩種傳代方式的陽性率間具有統(tǒng)計學差異；種內繁殖和種間繁殖群的平均離乳率分別為86.8％和100％，有統(tǒng)計學差異?？梢姡N間繁殖的陽性率及離乳率均高于種內繁殖。結果提示，含P301L突變的tau轉基因小鼠適合采用種間繁殖的方式傳代保種。 Western blot結果顯示，外源性Tau蛋白只在陽性鼠各腦組織分

5、區(qū)特異表達；泛素在陽性小鼠海馬和前額葉皮層的相對灰度為1319±0.186、1.469±0.131，陰性鼠為1.000±0.075、1.000±0.147，陽性鼠海馬和前額葉皮層的泛素表達增高與陰性鼠相比具有統(tǒng)計學差異；而顳葉和項葉皮層的泛素表達在陰性與陽性鼠間無差異。酶解熒光底物測定蛋白酶體活性結果顯示，糜蛋白酶樣活性與胰蛋白酶樣活性在陽性鼠海馬、糜蛋白酶樣活性與酸中毒樣水解酶活性在陽性鼠前額葉皮層均較陰性鼠低。推測在與學習記憶密切相

6、關的海馬和前額葉皮層，異常Tau蛋白表達促使機體動員更多的泛素進行底物泛素化，以促進其消除。但異常的Tau本身可以抑制蛋白酶體活性，阻礙異常Tau蛋白的降解，從而導致神經原纖維纏結的出現以及神經元死亡的發(fā)生。 前期實驗顯示：煙堿可誘導SH—SY5Y細胞泛素表達上調，并拮抗凋亡。本課題在此基礎上，研究三種膽堿能受體拮抗劑對煙堿誘導泛素上調的影響。Western blot結果發(fā)現，α—銀環(huán)蛇毒素及美加明都可以濃度依賴的抑制煙堿誘導的