抑制素α基因RNAi片段轉(zhuǎn)基因小鼠的干擾效果及其機(jī)理的初步研究.pdf

1、水牛是我國(guó)南方重要的地方品種，具有較強(qiáng)抗病及耐粗飼特性;水牛奶比荷斯坦奶牛的牛奶具有更高的蛋白率和乳脂率，在肉用和乳用等方面均具有很大的潛力，然而，水牛較低的繁殖性能制約著水牛業(yè)的發(fā)展。抑制素(Inhibin，INH)是重要的生殖激素，通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制促卵泡素(FSH，F(xiàn)ollicle-stimulating hormone)的合成與分泌來(lái)抑制卵巢的發(fā)育和卵泡的成熟以及精子的發(fā)生與成熟，目前已經(jīng)開(kāi)展了通過(guò)研制INH單基因疫苗免疫提高豬

2、、小鼠等動(dòng)物繁殖力的研究。
　　為了通過(guò)持續(xù)干擾INHα基因來(lái)改善水牛的繁殖性能，本研究利用顯微受精技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)將水牛INHα基因RNAi片段（B和C）和小鼠INHα基因RNAi片段（M和C，其中片段C為針對(duì)水牛和小鼠中相同CDs序列設(shè)計(jì)的）分別整合到小鼠基因組中（公司協(xié)助），以該三個(gè)不同RNAi片段轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠為研究材料，比較分析INHα基因三個(gè)不同RNAi片段的干擾作用及其效果，為研究INHα基因功能以及其在提高繁殖性能

3、打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)主要的結(jié)果如下:
　　1、INHα基因的三個(gè)不同RNAi片段的干擾作用及其效率的研究(1) INHα基因的RNAi片段干擾效率的分析:在F3代3周齡轉(zhuǎn)基因雌鼠中，采用PCR技術(shù)檢測(cè)其陽(yáng)性;然后，利用QPCR技術(shù)分析該轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性雌鼠的三個(gè)干擾片段的干擾效率，其干擾效率為C(96.1％)＞M(75.1％)＞B(27.5％)，可能是由于C片段是根據(jù)水牛和小鼠INHα基因共同CDs序列設(shè)計(jì)的且與干擾轉(zhuǎn)錄靶位點(diǎn)有關(guān);

4、　　(2) INHα基因的RNAi片段陽(yáng)性率的分析:提取F3代個(gè)體基因組DNA，用PCR分析后代轉(zhuǎn)基因子鼠陽(yáng)性比率，B、C和M片段在F3代中陽(yáng)性率依次為81.3％、51.1％和77.6％，即陽(yáng)性率B＞M＞C;
　　(3) INHα基因的RNAi片段對(duì)產(chǎn)仔性能作用的分析:統(tǒng)計(jì)和分析三個(gè)不同干擾片段轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠連續(xù)三代第一胎產(chǎn)仔數(shù)，與野生小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠后代的產(chǎn)仔數(shù)略有增加，B和M片段在F1、F2代第一胎產(chǎn)仔數(shù)有所增加，但沒(méi)有顯

5、著差異（P＞0.05）。此外，比較三個(gè)不同干擾片段轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠不同胎次產(chǎn)仔數(shù)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)仔數(shù)隨胎次的增加有所下降，且低于野生型小鼠;
　　(4) INHα基因的RNAi片段對(duì)生殖激素、生殖腺重量影響的分析:ELISA方法檢測(cè)F3代轉(zhuǎn)基因小鼠血液中FSH、雌激素和雄激素的水平，結(jié)果表明這三種激素水平均有所上升。與野生型小鼠相比，3周齡F3代轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸、卵巢及出生均重均顯著增加（P＜0.05）;
　　2、攜帶B干擾片段轉(zhuǎn)基因

6、小鼠不同交配方式轉(zhuǎn)基因后代干擾效果的比較分析:
　　根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇遺傳穩(wěn)定性較好、繁殖性能略高和生殖器官略重、根據(jù)水牛INHα基因序列設(shè)計(jì)的B干擾片段轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行不同交配方式配種(B×B、B×WT，以野生型WT×WT為對(duì)照)。
　　(5) INHα基因的RNAi片段不同配種方式對(duì)INHα基因干擾效率影響分析:B×WT型小鼠的干擾效率低于攜帶B×B純合小鼠后代，但干擾效率均達(dá)到70％以上，此外該雜交后代其陽(yáng)性比率高于純

7、合后代;
　　(6) INHα基因的RNAi片段不同配種方式對(duì)小鼠成活、血液免疫相關(guān)指標(biāo)影響的分析:轉(zhuǎn)基因小鼠(B×B、B×WT)存活率高于野生型;血常規(guī)分析顯示單核細(xì)胞數(shù)MO減少，淋巴細(xì)胞數(shù)LY增多，而紅細(xì)胞數(shù)RBC顯著增加（P＜0.05）;
　　(7) INHα基因的RNAi片段不同配種方式對(duì)睪丸支持細(xì)胞凋亡影響的分析:利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)分析了睪丸支持細(xì)胞的凋亡水平，轉(zhuǎn)基因小鼠(B×B)睪丸支持細(xì)胞凋亡率(5.4％)

8、顯著高于野生型小鼠(1.46％)。QPCR檢測(cè)相關(guān)凋亡因子P53和Bcl2，結(jié)果顯示這兩者mRNA水平均顯著下調(diào)，但抗凋亡因子Bcl2表達(dá)水平下降的程度比促凋亡因子P53更高;
　　(8) INHα基因的RNAi片段不同配種方式對(duì)支持細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)影響的分析:支持細(xì)胞上骨橋蛋白OPN(Osteopontin)在轉(zhuǎn)基因小鼠(B×B、B×WT)體內(nèi)表達(dá)顯著上升（P＜0.05）、FSH受體基因FSHR表達(dá)下降;細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)表明二者均定