RAX無義突變引起小鼠角膜混濁及其修飾基因的研究.pdf

1、角膜病是當(dāng)前致盲的主要眼病之一，在我國(guó)是繼白內(nèi)障疾病之后的第二大致盲眼病，約占15.4％。目前絕大多數(shù)嚴(yán)重威脅人類健康的疾病如糖尿病、高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病和精神分裂癥，還包括兒童先天性缺陷如唇裂、鄂裂及許多先天性心臟病也都受到多基因的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)室采用ENU化學(xué)誘變的方法獲得一種角膜混濁表型的小鼠模型，將其主基因鑒定為RAX并將該小鼠命名為RAX突變小鼠。本文是對(duì)RAX突變小鼠角膜特點(diǎn)及其修飾基因進(jìn)行研究，主要分為以下三個(gè)方面:

2、　　1、RAX無義突變小鼠角膜特點(diǎn)的研究
　　本文以RAX無義突變小鼠為研究對(duì)象，將該小鼠與正常B6小鼠繁殖，篩選具有角膜混濁表型的雜合子小鼠。對(duì)角膜混濁小鼠眼球進(jìn)行組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，突變小鼠角膜基質(zhì)層及角膜層明顯變薄，且角膜表層細(xì)胞呈水泡樣。再采用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)該8W以上小鼠進(jìn)行蛋白分子分析，結(jié)果顯示突變小鼠角膜蛋白Cytokeratin12(K12)、Cytokeratin14(K14)、Cytokeratin13(K13

3、)及PAX6均發(fā)生了變化。
　　2、角膜混濁修飾基因的定位
　　采用將B6背景角膜混濁雜合子小鼠與D2小鼠配種獲得F1代小鼠，F(xiàn)1代小鼠繼續(xù)回交B6獲得[(B6×D2) B6]N2代的方案獲得角膜混濁雜合子。篩選突變雜合子N2代小鼠1782只，其中180只小鼠表現(xiàn)有角膜混濁表型，通過基因連鎖分析結(jié)果修飾基因與微衛(wèi)星D1Mit145連鎖(LOD值5.97)，初步將該基因定位于小鼠第1號(hào)染色體上。為對(duì)該修飾基因進(jìn)行精確定位，在1

4、號(hào)染色體上增加微衛(wèi)星密度，最終將該修飾基因定位于1號(hào)染色體68.38cM-74.68cM之內(nèi)。
　　3、角膜混濁修飾基因的鑒定
　　根據(jù)定位結(jié)果，通過MGI數(shù)據(jù)庫查詢?cè)撔∈笮揎椈蚨ㄎ粎^(qū)域附近相關(guān)基因，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行基因功能分析，最終初步將候選基因確定為:Pou2f1。繼而對(duì)候選目的基因設(shè)計(jì)引物，分別PCR擴(kuò)增候選目的基因，切膠回收后測(cè)序，將以上測(cè)序結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中心野生型B6小鼠、D2小鼠基因序列進(jìn)行對(duì)比，篩查突變位點(diǎn)。P