FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體化學(xué)發(fā)光快速檢測(cè)試劑盒的研發(fā).pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth diseases，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseases virus，F(xiàn)MDV)引起的危害豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物的重大動(dòng)物傳染病。在臨床診斷中，早期、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)FMDV感染對(duì)于防控FMD的大流行來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminiscence immunoassay, CLIA)作為最新的標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，由于其具有極高的敏感性、信噪比以及寬的線

2、性范圍而在診斷艾滋病、肝炎、腫瘤等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。目前關(guān)于診斷FMD的CLIA方法還未見報(bào)道。
　　本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了FMDV的非結(jié)構(gòu)全長(zhǎng)蛋白3ABC、2C和五株位于3A、3B上的單表位蛋白分別命名為3Aepi1、3Aepi2、3Bepi1、3Bepi2、3Bepi3。其中，3ABC和2C蛋白以包涵體的形式表達(dá)，五株單表位蛋白以可溶性的形式表達(dá)。利用親和層析等層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)上述蛋白的高通量純化。Western blo

3、t結(jié)果顯示，純化后的所有蛋白都能和FMDV感染陽(yáng)性血清反應(yīng)。間接ELISA結(jié)果表明3ABC、2C、3Bepi1、3Bepi2蛋白具有良好地區(qū)分FMDV感染陽(yáng)性血清和陰性血清的能力。
　　分別將單獨(dú)的3ABC蛋白和混合的3ABC和2C蛋白作為包被抗原成功建立了兩種檢測(cè)豬FMDV感染的CLIA方法，即豬-3ABC-CLIA和豬-3ABC-2C-CLIA。通過(guò)檢測(cè)712份已知FMD背景的豬血清表明豬-3ABC-2C-CLIA（診斷敏感性

4、為100％，診斷特異性為96.47％）的準(zhǔn)確性要明顯高于豬-3ABC-CLIA(診斷敏感性為95.73％，診斷特異性為95.87％)。通過(guò)對(duì)田間962份樣品的檢測(cè)表明豬-3ABC-2C-CLIA與國(guó)產(chǎn)商品化ELISA試劑盒的符合率為96.15％，與進(jìn)口商品化試劑盒的符合率為97.81％。通過(guò)對(duì)感染FMDV的豬進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)表明，在通常情況下，各商品化ELISA試劑盒最早可以在感染后的6d-9d判定豬感染了FMDV，相比之下，豬-3ABC

5、-2C-CLIA在感染后的1 d-4d即可判定豬感染FMDV。此外，該CLIA方法具有檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)，可在15min內(nèi)完成檢測(cè)，并具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。
　　在此基礎(chǔ)上，成功建立了檢測(cè)?？谔阋叻墙Y(jié)構(gòu)蛋白抗體的CLIA方法即牛-3ABC-2C-CLIA。通過(guò)檢測(cè)460份已知FMD背景的牛血清表明該方法診斷敏感性為96.86％、診斷特異性為93.38％。通過(guò)對(duì)田間810份隨機(jī)樣品的檢測(cè)表明該CLIA方法與國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒的符合