阿托伐他汀促進(jìn)大鼠體內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白支架血管化的初步研究.pdf

1、目的：近年來，以生長因子，種子細(xì)胞和載體支架為基礎(chǔ)的組織工程的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，然而在臨床應(yīng)用方面的效果卻并不理想。究其原因，很大程度上是因?yàn)橐浦参镅芫W(wǎng)缺乏，血液供應(yīng)不足而造成的細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)障礙。以往的研究證實(shí)，種子細(xì)胞的存活范圍在血供彌散的150-200μm內(nèi)。如果組織工程移植物的血管化問題不能解決，具有較大體積的組織工程移植物的臨床應(yīng)用就難以實(shí)現(xiàn)。最近，用各種血管生長因子及其轉(zhuǎn)基因技術(shù)促進(jìn)組織工程移植物血管新生的作用有很多報(bào)

2、道。但由于多種血管生長因子本身的局限性及轉(zhuǎn)基因治療中尚存在許多問題，使其在臨床上的應(yīng)用受到了限制，所以尋找以誘導(dǎo)血管新生為基點(diǎn)的方便、有效、實(shí)用的藥物來促進(jìn)組織工程移植物的血管生長具有重要的臨床意義，是組織工程學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 他汀類藥物作為HMG—CoA還原酶抑制劑，是臨床常用的降血脂藥。體外的血管新生共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，阿托伐他汀具有促血管樣結(jié)構(gòu)形成的作用。如果阿托伐他汀能做為促血管新生藥物用于組織工程移植物中，將會(huì)為組織工程

3、移植物的血管化帶來新的希望。本實(shí)驗(yàn)將Ⅰ型膠原蛋白支架植入大鼠皮下，用阿托伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行灌胃，通過觀察Ⅰ型膠原蛋白支架中VEGF、CD34的陽性細(xì)胞、血管樣結(jié)構(gòu)及VEGFmRNA的表達(dá)，來探討阿托伐他汀是否能作為促血管新生藥物促進(jìn)組織工程移植物的血管化。 方法：1.Ⅰ型膠原蛋白支架的形態(tài)學(xué)觀察。(1)伊紅染色：長寬高各5mm的Ⅰ型膠原蛋白支架一塊，置入冷凍包埋劑中，液氮速凍后行連續(xù)冰凍切片，厚度為8μm。切片置入4％多聚甲醛

4、中固定30min，流水沖洗后行常規(guī)伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下采集圖像。(2)掃描電鏡：長寬高各5mm的Ⅰ型膠原蛋白支架一塊，用2.5％戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，掃描電鏡觀察并采集圖像。2.Ⅰ型膠原蛋白支架的體內(nèi)植入及分組：取Wistar大鼠(40只)，雌雄不限，體重90-100g，在雙側(cè)大腿背側(cè)中點(diǎn)皮下植入體積為125mm3的Ⅰ型膠原蛋白支架。手術(shù)后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(20只)和對(duì)照組(20只)。3.應(yīng)用阿托伐他汀灌胃：從術(shù)后

5、第1d開始，實(shí)驗(yàn)組大鼠給予阿托伐他汀溶液灌胃(1mg/kg)，對(duì)照組大鼠則給予等量生理鹽水做對(duì)照，每日一次。術(shù)后第14d處死大鼠，取出植入的Ⅰ型膠原蛋白支架。一部分置入冷凍包埋劑中，液氮速凍后于—70℃冰箱冷凍保存，以備做免疫組織化學(xué)分析；另一部分置入Trizol試劑中，—70℃冰箱冷凍保存，以備做RT-PCR檢測(cè)。4.免疫組織化學(xué)染色：將—70℃冰箱冷凍保存的冷凍包埋劑中的Ⅰ型膠原蛋白支架行連續(xù)冰凍切片，厚度為8μm。切片分別進(jìn)行VE

6、GF抗體和CD34抗體免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下采集圖象。5.RT-PCR檢測(cè)：用RT-PCR檢測(cè)術(shù)后第14d兩組大鼠Ⅰ型膠原蛋白支架中VEGFmRNA的表達(dá)情況。PCR產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：150V，30min)，Tanon凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)掃描電泳條帶。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果：1.Ⅰ型膠原蛋白支架形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：(1)伊紅染色可見，Ⅰ型膠原蛋白支架被染成紅色，結(jié)構(gòu)

7、疏松，具有典型的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小150-200μm。(2)掃描電鏡觀察，Ⅰ型膠原蛋白支架表面光滑，有少許皺褶形成。2.術(shù)后大鼠一般情況及切口愈合的觀察結(jié)果：術(shù)后1小時(shí)，大鼠清醒，活動(dòng)較好，正常進(jìn)食飲水，大腿背部的切口干燥整齊。以后體重逐漸增加，至術(shù)后第14d，兩組大鼠切口均愈合良好，未見感染。3.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：CD34陽性細(xì)胞多位于支架邊緣部分，棕黃色陽性顆粒均勻的分散于胞膜中，陽性細(xì)胞多形成管徑為6—10μm的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)

8、。實(shí)驗(yàn)組(圖2)陽性細(xì)胞較對(duì)照組多。VEGF染色可見棕黃色顆粒沉淀于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外基質(zhì)中。陽性表達(dá)部位未見毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成，周圍可見散在的紅細(xì)胞存在。實(shí)驗(yàn)組陽性表達(dá)部位較對(duì)照組多。4.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組VEGFmRNA的表達(dá)明顯較對(duì)照組高。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)組CD34、VEGF和VEGFmRNA的表達(dá)均較對(duì)照組高，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：阿托伐他汀可以上調(diào)大鼠體內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白支架中VEGFmRNA