阿托伐他汀促進大鼠體內Ⅰ型膠原蛋白支架血管化的初步研究.pdf

1、目的：近年來，以生長因子，種子細胞和載體支架為基礎的組織工程的研究已經(jīng)取得了很大進展，然而在臨床應用方面的效果卻并不理想。究其原因，很大程度上是因為移植物血管網(wǎng)缺乏，血液供應不足而造成的細胞營養(yǎng)供應障礙。以往的研究證實，種子細胞的存活范圍在血供彌散的150-200μm內。如果組織工程移植物的血管化問題不能解決，具有較大體積的組織工程移植物的臨床應用就難以實現(xiàn)。最近，用各種血管生長因子及其轉基因技術促進組織工程移植物血管新生的作用有很多報

2、道。但由于多種血管生長因子本身的局限性及轉基因治療中尚存在許多問題，使其在臨床上的應用受到了限制，所以尋找以誘導血管新生為基點的方便、有效、實用的藥物來促進組織工程移植物的血管生長具有重要的臨床意義，是組織工程學研究的一個熱點。 他汀類藥物作為HMG—CoA還原酶抑制劑，是臨床常用的降血脂藥。體外的血管新生共培養(yǎng)實驗表明，阿托伐他汀具有促血管樣結構形成的作用。如果阿托伐他汀能做為促血管新生藥物用于組織工程移植物中，將會為組織工程

3、移植物的血管化帶來新的希望。本實驗將Ⅰ型膠原蛋白支架植入大鼠皮下，用阿托伐他汀對實驗大鼠進行灌胃，通過觀察Ⅰ型膠原蛋白支架中VEGF、CD34的陽性細胞、血管樣結構及VEGFmRNA的表達，來探討阿托伐他汀是否能作為促血管新生藥物促進組織工程移植物的血管化。 方法：1.Ⅰ型膠原蛋白支架的形態(tài)學觀察。(1)伊紅染色：長寬高各5mm的Ⅰ型膠原蛋白支架一塊，置入冷凍包埋劑中，液氮速凍后行連續(xù)冰凍切片，厚度為8μm。切片置入4％多聚甲醛

4、中固定30min，流水沖洗后行常規(guī)伊紅染色，光學顯微鏡下采集圖像。(2)掃描電鏡：長寬高各5mm的Ⅰ型膠原蛋白支架一塊，用2.5％戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡觀察并采集圖像。2.Ⅰ型膠原蛋白支架的體內植入及分組：取Wistar大鼠(40只)，雌雄不限，體重90-100g，在雙側大腿背側中點皮下植入體積為125mm3的Ⅰ型膠原蛋白支架。手術后隨機分為實驗組(20只)和對照組(20只)。3.應用阿托伐他汀灌胃：從術后

5、第1d開始，實驗組大鼠給予阿托伐他汀溶液灌胃(1mg/kg)，對照組大鼠則給予等量生理鹽水做對照，每日一次。術后第14d處死大鼠，取出植入的Ⅰ型膠原蛋白支架。一部分置入冷凍包埋劑中，液氮速凍后于—70℃冰箱冷凍保存，以備做免疫組織化學分析；另一部分置入Trizol試劑中，—70℃冰箱冷凍保存，以備做RT-PCR檢測。4.免疫組織化學染色：將—70℃冰箱冷凍保存的冷凍包埋劑中的Ⅰ型膠原蛋白支架行連續(xù)冰凍切片，厚度為8μm。切片分別進行VE

6、GF抗體和CD34抗體免疫組織化學染色，光學顯微鏡下采集圖象。5.RT-PCR檢測：用RT-PCR檢測術后第14d兩組大鼠Ⅰ型膠原蛋白支架中VEGFmRNA的表達情況。PCR產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：150V，30min)，Tanon凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)掃描電泳條帶。6.統(tǒng)計學處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。 結果：1.Ⅰ型膠原蛋白支架形態(tài)學觀察結果：(1)伊紅染色可見，Ⅰ型膠原蛋白支架被染成紅色，結構

7、疏松，具有典型的多孔結構，孔徑大小150-200μm。(2)掃描電鏡觀察，Ⅰ型膠原蛋白支架表面光滑，有少許皺褶形成。2.術后大鼠一般情況及切口愈合的觀察結果：術后1小時，大鼠清醒，活動較好，正常進食飲水，大腿背部的切口干燥整齊。以后體重逐漸增加，至術后第14d，兩組大鼠切口均愈合良好，未見感染。3.免疫組織化學染色結果：CD34陽性細胞多位于支架邊緣部分，棕黃色陽性顆粒均勻的分散于胞膜中，陽性細胞多形成管徑為6—10μm的毛細血管樣結構

8、。實驗組(圖2)陽性細胞較對照組多。VEGF染色可見棕黃色顆粒沉淀于細胞質或細胞外基質中。陽性表達部位未見毛細血管樣結構形成，周圍可見散在的紅細胞存在。實驗組陽性表達部位較對照組多。4.RT-PCR檢測結果：實驗組VEGFmRNA的表達明顯較對照組高。5.統(tǒng)計學分析：實驗組CD34、VEGF和VEGFmRNA的表達均較對照組高，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。 結論：阿托伐他汀可以上調大鼠體內Ⅰ型膠原蛋白支架中VEGFmRNA