阿托伐他汀對血管內(nèi)皮細胞自噬作用的研究.pdf

1、第一部分:大鼠血管內(nèi)皮細胞自噬模型的構(gòu)建及電鏡鑒定 目的：為研究阿托伐他汀對血管內(nèi)皮細胞自噬作用的影響，我們構(gòu)建了大鼠血管內(nèi)皮細胞自噬模型. 方法：貼塊法原代培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞，經(jīng)免疫細胞化學法(S—P法)鑒定。血管內(nèi)皮細胞傳至第3代時，取對數(shù)生長期細胞，換用3％胎牛血清(FBS)的DMEM液培養(yǎng)12h使細胞同步化。所選細胞換用20％FBS的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)細胞24h后，用PBS液洗滌3遍，加入與原培養(yǎng)基相

2、同體積的Hanks'液孵育30分鐘后收獲細胞。將得到的細胞制作成電鏡標本，觀察，攝片。 結(jié)果：1在倒置相差顯微鏡下觀察，正常細胞生長良好，呈扁平多角形，邊界清楚，胞質(zhì)豐富，核圓形或橢圓形，居中，偶見雙核，隨細胞密度增加呈現(xiàn)“鋪路石樣”排列。 2熒光顯微鏡下可見細胞胞漿內(nèi)均呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達Ⅷ因子，符合內(nèi)皮細胞特征。 3經(jīng)透射電鏡觀測所構(gòu)建的細胞自噬模型，發(fā)現(xiàn)各細胞中均出現(xiàn)包裹有未降解的胞漿物質(zhì)、細胞器的雙

3、層膜結(jié)構(gòu)，高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其為典型的自噬體結(jié)構(gòu)，自噬模型構(gòu)建成功。 結(jié)論：本研究結(jié)果為進一步進行阿托伐他汀對血管內(nèi)皮細胞自噬作用的研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分阿托伐他汀對血管內(nèi)皮細胞自噬作用的影響 目的：觀察不同時相使用阿托伐他汀對血管內(nèi)皮細胞自噬的影響，探討其保護血管內(nèi)皮細胞的可能機制。 方法：采用Hanks’液替代培養(yǎng)基以饑餓誘導的方法，使血管內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬。在誘導自噬前和誘導過程中，使細胞分別與含或

4、不含阿托伐他汀的正常培養(yǎng)基或Hanks'液共孵育，并隨機分為空白對照組(Ⅰ組)、誘導前和誘導中都應(yīng)用阿托伐他汀組(Ⅱ組)、僅在誘導中應(yīng)用阿托伐他汀組(Ⅲ組)和僅在誘導前應(yīng)用阿托伐他汀組(Ⅳ組)。應(yīng)用透射電鏡檢測各組細胞自噬的發(fā)生情況，RT—PCR技術(shù)檢測組間Beclin1和Mapllc3兩基因的表達。 結(jié)果：與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅲ組的Beclin1和Mapllc3兩基因mRNA表達均明顯降低(P＜0.01)。Ⅳ組的表達低于Ⅰ組，無