Fonsecaea monophora的致病性研究.pdf

1、目的:對疑是著色芽生菌病患者皮損分離的病原菌進行培養(yǎng)及菌種鑒定，并構建該菌種感染小鼠的動物模型，探索該菌種的致病性以及體外對有關抗真菌藥物的敏感性。
　　 方法:取患者皮損及分泌物進行組織病理學及真菌學檢查，對培養(yǎng)出來的病原菌菌種利用形態(tài)學技術進行初步鑒定；然后，再采用分子生物學技術對所獲菌種進行基因鑒定。提取病原菌DNA，利用真菌通用引物ITS1和ITS4進行rDNA ITS區(qū)系列的PCR擴增，利用引物NS1和DNS6進行rD

2、NA18S區(qū)序列的PCR擴增，擴增產(chǎn)物測序后在Genbank核酸數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對。按照CLSI制定的M38-A方案對菌株進行體外抗真菌藥物敏感實驗。動物模型采用ICR小鼠，分為：A組為實驗組、B組為生理鹽水對照組。接種部位：灌胃、皮膚、足墊、睪丸、腦室、腹腔；接種后每天觀察接種部位及小鼠的變化；接種后15d、1、2個月逐次處死各組不同接種部位老鼠2只，取肉眼可見的病變組織行病理學、真菌學及分子生物學檢查。
　　 結果:皮損

3、組織病理為慢性肉芽腫樣改變，可見圓形厚壁的硬殼細胞。皮損處分泌物及組織液在含氯霉素的SDA，PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落生長緩慢，呈橄欖色至灰黑色。小培養(yǎng)可見大量棕色分支分隔菌絲、分生孢子梗主要為喙枝孢型和枝孢型為主，枝狀鏈及串狀芽生孢子，呈橢圓形或卵圓形，單細胞。擴增真菌rDNA的ITS區(qū)得到554 bp的系列片段，rDNA的18S區(qū)得到1300 bp的系列片段，將PCR產(chǎn)物測序后獲得的DNA系列片段在GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫中blan

4、sen比對結果：該病原菌的rDNA的18S區(qū)得到系列的片段分析將該菌種確定為著色真菌屬，其rDNA的ITS區(qū)得到系列的片段，經(jīng)序列分析與裴氏著色真菌m onophora(Fonsecaea monophora)的變種ITS區(qū)比對一致性為100％。結合患者組織病理、真菌學形態(tài)結構特征以及DNA序列分析，該菌種被鑒定為Fonsecaea monophora。體外藥敏試驗結果顯示：該菌對伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、酮康唑均敏感。本例患者予以伊

5、曲康唑聯(lián)合外用抗真菌制劑治療半年痊愈，但停藥1個月復發(fā)。動物模型：灌胃接種未出現(xiàn)任何異常變化；皮內(nèi)接種后隨時間進展，出現(xiàn)結節(jié)、水皰、膿皰、潰瘍、壞死、暗紅色痂，萎縮伴黑色痂，皮下接種表皮未出現(xiàn)破潰和結痂；足墊接種見足墊腫脹增厚、跛行，余表現(xiàn)同皮內(nèi)接種；腹腔接種早期體外未見明顯變化，后期出現(xiàn)腹部膨隆，解剖見腹腔內(nèi)大量腹水，受累臟器及其系膜粘連，表面布滿粟粒至綠豆大黑色結節(jié)，同時受累的還有泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)，有小鼠出現(xiàn)尿失禁及雙后肢癱瘓

6、，但胸腔未受累；睪丸接種出現(xiàn)陰囊腫脹發(fā)亮、膿皰、破潰，睪丸萎縮、發(fā)黑，解剖可見大量黑色結節(jié)沿睪丸組織種植播散到腹腔致腹腔內(nèi)各臟器系統(tǒng)性感染；腦室接種見囟門區(qū)膨出黑色膿皰并逐漸增大，小鼠出現(xiàn)單側眼球化膿性感染以致失明，15d后陸續(xù)死亡。整個實驗過程中除腦室內(nèi)接種小鼠全部死亡外，余未見死亡。實驗組除灌胃接種未出現(xiàn)反應外，余接種途徑均100％感染。對照組未出現(xiàn)任何反應。接種后的15d、1、2個月逐次處死各接種組2只老鼠，取肉眼可見的病變組織行

7、病理學及真菌學檢查，可見肉芽腫性炎癥改變，病變組織中均可找到硬殼小體，培養(yǎng)見黑色菌落生長，鏡下形態(tài)與皮損分泌物培養(yǎng)的菌的鏡下形態(tài)相同。挑出黑色菌落再次進行分子生物學鑒定結果同前。結合組織病理學、真菌學及分子生物學將該菌種鑒定為Fonsecaea monophora，其引起的著色芽生菌病病程遷延，需長程治療。
　　 結論:著色芽生菌新菌種Fonsecaea monophora通過分子生物學技術從裴氏著色霉中分離鑒定出來，其引起的著