牛支原體生長特性及其致病性研究.pdf

1、牛支原體(Mycoplasma bovis)作為感染牛的一種重要的致病性霉形體，可以引起包括肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道損傷以及結(jié)膜炎等在內(nèi)的多種疾病，同時還可與其他病原協(xié)同，造成繼發(fā)感染。目前，國內(nèi)外關(guān)于牛支原體的研究主要集中在病原的免疫及核酸鑒別診斷方面，國外研究較為深入；國內(nèi)研究卻處于起步階段，這主要和我國牛支原體流行較晚、規(guī)模不大所致。而關(guān)于牛支原體病原學(xué)特征、致病性及其致病機制的研究報道較少。因此，本課題從牛支原體的生長特性、

2、致病性兩個方面，開展了對牛支原體的分離培養(yǎng)、鑒定、生化特性、表性特征、實驗動物感染等試驗。并采用PCR、CCU顏色改變單位、顯微鏡檢、分光光度法等方法獲取實驗相關(guān)數(shù)據(jù)，并分析得出牛支原體各分離株生長特性和致病力強弱，篩選出優(yōu)勢流行菌株為后期ELISA診斷試劑盒的開發(fā)、疫苗的研制提供參考依。為進一步預(yù)防和控制牛支原體及其支原體病奠定理論基礎(chǔ)。
　　 1、牛支原體分離、培養(yǎng)及其鑒定
　　 本試驗采用改良的支原體培養(yǎng)基對4個省

3、市5個肉牛場中呼吸道癥狀較重的病?；蛩琅５姆闻K進行病原分離、培養(yǎng)及純化，并通過PCR鑒定為牛支原體(Mycoplasma bovis，牛支原體)。改良的液體培養(yǎng)基比較適合牛支原體的生長繁殖，培養(yǎng)時間相對減少，尤其在傳代培養(yǎng)時，平均變色時間僅需24h左右。同時，建立的牛支原體PCR檢測方法具有特異性較好、靈敏度較高、且操作簡單等特點，其檢測結(jié)果可以作為臨床疾病診斷的參考依據(jù)。
　　 2、牛支原體生長特性研究
　　 采用已純

4、化鑒定的6個牛支原體分離株(W70株、1738株、Q1株、Q3株、JX02株、677株)，進行生長特性研究。采用革蘭氏、姬母薩、迪那氏染色對菌體和菌落進行形態(tài)特征的觀察。結(jié)果表明：革蘭氏染色紅色，姬母薩染色紫藍(lán)色；菌體均表現(xiàn)為多形性，以球狀和短桿狀為主。顯微鏡檢，菌落呈典型的“油煎蛋樣”，姬母薩、迪那氏著色效果較好。通過葡萄糖發(fā)酵、精氨酸發(fā)酵等生化反應(yīng)觀察6個牛支原體分離株純培養(yǎng)物的生化特性。結(jié)果表明：牛支原體屬非發(fā)酵類支原體。生長過程

5、中，不能利用大多數(shù)的糖、精氨酸以及尿素，但可以利用乳糖。采用分光光度法，入射波長為630nm繪制牛支原體生長周期曲線；“三點法”測定生長中pH變化。結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)時間的累積，pH值逐漸下降，且以48h內(nèi)降幅較大；與此同時，隨著時間的累積，菌液OD值逐漸升高，且同樣以48h內(nèi)增幅最大。表明各牛支原體分離在培養(yǎng)48h左右菌體生長可能到達(dá)最大限度。
　　 本試驗采用濃度為1010CCU/ml的6個牛支原體分離株菌液純培養(yǎng)物，對7日

6、齡健康雞胚和6-8周齡SPF級BALB/c小鼠進行感染攻毒實驗。雞胚攻毒實驗表明：牛支原體在雞胚上生長良好，且可造成雞胚的大量死亡；充血和出血現(xiàn)象較為明顯。不同接種方式、不同牛支原體分離株對雞胚致死作用差異顯著(P<0.05)。不同牛支原體分離株對雞胚致死作用差異顯著(P<0.05)，以W70株、1738株致死率較高，Q1株、Q3株次之，677株死亡率最低。BABL/c小鼠感染后，雖然出現(xiàn)增重抑制，脾指數(shù)、肺指數(shù)上升的異常變化；但是，在

7、攻毒時與攻毒后，均未出現(xiàn)臨床呼吸道疾病癥狀和肺部病理損傷變化，并經(jīng)病原學(xué)分離鑒定未發(fā)現(xiàn)牛支原體生長。
　　 綜上所述，在牛支原體的實驗室微生物診斷中，可以參考本試驗所改良的牛支原體分離培養(yǎng)基及其PCR鑒定程序，作為病原分離和疾病診斷的方法；同時，牛支原體在48h左右即可達(dá)到對數(shù)生長期，在菌種保存或、菌株復(fù)壯、增菌擴培時可作為參考依據(jù)；在牛支原體的致病性研究中，可參考本實驗所選用的健康雞胚，作為疾病病理研究動物模型；BABL/c小