4，5-雙氫格爾德霉素組分檢測及格爾德霉素生物合成后修飾研究.pdf

1、鏈霉菌以其產(chǎn)生眾多有價值的生理活性物質(zhì)在醫(yī)藥工業(yè)中占有重要的地位，尤其是吸水鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的多樣性更值得關(guān)注。吸水鏈霉菌17997(Streptomyceshygroscopicus17997)是從我國土壤中分離得到的一株格爾德霉素(geldanamycin，GDM)產(chǎn)生菌，近年來研究發(fā)現(xiàn)GDM具有抗腫瘤和抗病毒等活性，是熱休克蛋白90的特異性抑制劑，現(xiàn)成為在抗癌和抗病毒領(lǐng)域中非常有潛力的藥物。 本論文對S．hygrosco

2、picus17997進(jìn)行了發(fā)酵跟蹤，研究了菌株17997的生長及發(fā)酵周期，表明其生長始于0-12h，對數(shù)生長期是24-60h，穩(wěn)定期是60-120h；發(fā)酵培養(yǎng)的生長期為12-48h，抗生素(格爾德霉素)合成期為48-108h。 對來自S．hygroscopicus17997的格爾德霉素制品進(jìn)行了LC-MS-MS分析，發(fā)現(xiàn)其中含有4，5-雙氫格爾德霉素組分和其它幾種格爾德霉素結(jié)構(gòu)類似物。對S．hygroscopicus17997搖

3、瓶發(fā)酵產(chǎn)物的硅膠板薄層層析分析表明，4，5-雙氫格爾德霉素組分在發(fā)酵中期有積累。 已知4，5-雙氫格爾德霉素的抗腫瘤活性比格爾德霉素差，因而需要限制其在格爾德霉素制品中的含量。 本論文研究結(jié)果對以吸水鏈霉菌17997等為產(chǎn)生菌研究格爾德霉素發(fā)酵，促進(jìn)4，5-雙氫格爾德霉素轉(zhuǎn)化為格爾德霉素以提高發(fā)酵液的品質(zhì)，以及檢測格爾德霉素制品中的4，5-雙氫格爾德霉素組分具有實(shí)際意義。 格爾德霉素安莎鏈C4，C5位之間的碳碳鍵

4、在格爾德霉素生物合成過程中經(jīng)歷了雙鍵→單鍵→雙鍵這樣一個循環(huán)，目前推測它對于完成格爾德霉素生物合成PKS后修飾步驟具有重要意義。已知GDM生物合成基因簇的PKSmodule6中的ER(烯酰還原酶)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)催化C4，C5位碳碳之間的雙鍵→單鍵步驟，格爾德霉素生物合成后修飾基因gdmP參與了單鍵→雙鍵步驟。通過破壞格爾德霉素生物合成過程中C4，C5位碳碳之間的單雙鍵循環(huán)變化，可以深入了解其在格爾德霉素生物合成中的作用。 對烯酰還原

5、酶結(jié)構(gòu)域中NADPH結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，可以有效地失活該結(jié)構(gòu)域的催化活性，同時不影響PKS后續(xù)結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)的催化活性。本論文采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，在體外對PKSmodule6ER的NADPH結(jié)合位點(diǎn)引入突變位點(diǎn)以破壞其NADPH結(jié)合功能，進(jìn)而失活其催化活性，然后通過接合轉(zhuǎn)移、DNA同源雙交換技術(shù)，將突變失活的ER替換吸水鏈霉菌17997的野生型ER，篩選獲得突變株，對變株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，有可能揭示格爾德霉素生物合成過程中C4，C5位碳碳