力達(dá)霉素對卵巢癌抑制作用及聯(lián)合Hsp90抑制劑格爾德霉素及其衍生物的協(xié)同作用研究.pdf

1、細(xì)胞中受到外界DNA損傷物質(zhì)的侵害后會激活自身修復(fù)DNA的途徑來進(jìn)行DNA的損傷后修復(fù)，這是許多誘導(dǎo)DNA損傷藥物發(fā)生耐藥或劑量升高的重要原因之一。通過降低細(xì)胞內(nèi)部的DNA損傷后修復(fù)水平來增敏DNA損傷藥物是尋找放療、化療增敏劑可行的方法。細(xì)胞在接受DNA損傷因素的作用后是否能夠存活主要取決于DNA雙鏈斷裂程度。ATM/ATR等PIKKs成員在應(yīng)答DNA損傷、維持基因組穩(wěn)定性過程中扮演重要的角色，它們傳遞基因組損傷的信號、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)

2、程并且促進(jìn)DNA修復(fù)。ATM主要對DNA雙鏈斷裂進(jìn)行應(yīng)答，下游最重要的底物是Chk2；ATR對DNA單鏈斷裂、交聯(lián)或者復(fù)制叉進(jìn)行應(yīng)答，下游的重要底物有Chk1和BRCA1等。Chk1和Chk2都將細(xì)胞阻滯在G2/M期，抑制DNA復(fù)制，促進(jìn)受損的DNA進(jìn)行修復(fù)。
　　 力達(dá)霉素（lidamycin，LDM；又名C-1027）是烯二炔類（enediyne）抗腫瘤抗生素家族的成員之一，通過誘導(dǎo)DNA斷裂可以達(dá)到強(qiáng)烈的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，

3、在中國正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗。作為一種DNA損傷藥物，力達(dá)霉素同樣能夠激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)通路，這可能是影響其療效的主要原因之一。Hsp90是人們非常關(guān)注的治療腫瘤的一個靶點，目前有多種Hsp90抑制劑正在進(jìn)行臨床試驗，單獨的Hsp90抑制劑并不能發(fā)揮很好的效果，但研究中發(fā)現(xiàn)Hsp90抑制劑與很多種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用效果良好，能夠起到增敏的作用。關(guān)于Hsp90抑制劑增敏化療藥物的機(jī)制眾說紛紜，可能根據(jù)化療藥物的不同，Hsp90所抑制的

4、通路所起的作用也不盡相同。其中許多研究證實Hsp90抑制劑可以降低基因組的穩(wěn)定性。本研究主要研究了Hsp90抑制劑格爾德霉素及其衍生物CNDG與力達(dá)霉素聯(lián)合給藥后對力達(dá)霉素在人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中的增敏作用，觀察聯(lián)合給藥后細(xì)胞的生長、增殖、DNA損傷水平，探討Hsp90抑制劑對力達(dá)霉素增敏的作用機(jī)制。
　　 Hsp90抑制劑我們選擇了典型的格爾德霉素（Geldanamycin，GDM）和由本實驗室合成的格爾德霉素衍生物CND

5、G。
　　 一、力達(dá)霉素對卵巢癌細(xì)胞的影響
　　 MTT檢測表明，LDM（0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM和0.1nM）作用于SKOV-3細(xì)胞24小時后，可以呈劑量依賴性的抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡比率隨濃度增加而升高。Western blot檢測顯示0.01nM的力達(dá)霉素可以增強(qiáng)HER2的磷酸化水平，而0.1和1 nM的力達(dá)霉素降低HER2的磷酸化。在體外模擬缺氧條件用COCl2處理細(xì)胞體外模擬腫瘤的缺氧

6、狀態(tài)，結(jié)果顯示力達(dá)霉素可以明顯的降低缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的水平。
　　 二、Hsp90抑制劑可以增強(qiáng)力達(dá)霉素對卵巢癌SKOV-3、乳腺癌MCF-7、肺癌A-549、肝癌Be1-7402細(xì)胞的殺傷作用
　　 用MTT法檢測力達(dá)霉素與格爾德霉素（GDM）聯(lián)合應(yīng)用對卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的影響，計算力達(dá)霉素（0.01nM、0.05nM）與格爾德霉素（10nM、50nM、100nM、500nM、100nM）單藥及聯(lián)合后對

7、卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的抑制作用，并通過公式計算其聯(lián)合指數(shù)，力達(dá)霉素與格爾德霉素100nM、500nM聯(lián)合作用有明顯的聯(lián)合抑制細(xì)胞增殖的作用。CNDG與力達(dá)霉素聯(lián)合可顯示與格爾德霉素相似的作用。實驗表明力達(dá)霉素與Hsp90抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可以明顯增強(qiáng)抑制細(xì)胞增殖的水平。
　　 同樣的實驗條件，我們選擇了三種其他種類的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實驗，Hsp90抑制劑同樣能夠增強(qiáng)力達(dá)霉素對細(xì)胞的殺傷能力，伴隨著誘導(dǎo)凋亡的增加、DNA損傷后

8、修復(fù)的減少，G2/M期阻滯降低等現(xiàn)象，說明Hsp90抑制劑對力達(dá)霉素的增效作用是可以廣泛適用于多種腫瘤細(xì)胞。
　　 三、Hsp90抑制劑增強(qiáng)力達(dá)霉素對SKOV-3細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用
　　 以不同濃度格爾德霉素預(yù)處理SKOV-3細(xì)胞16小時，力達(dá)霉素（0.01nM，0.05nM）作用于24h后，PARP的切割水平在聯(lián)合應(yīng)用時大幅度升高；用Annexin V-PI雙染檢測凋亡細(xì)胞，其中0.05 nmol/LDM作用于SKOV

9、-3細(xì)胞凋亡率為14％，200nM格爾德霉素作用于SKOV-3細(xì)胞凋亡率為16.1％，兩者聯(lián)合后細(xì)胞的凋亡比例為32.2％，單獨用藥與聯(lián)合用藥相比P<0.01。聯(lián)合指數(shù)0.89。
　　 四、Hsp90抑制劑增強(qiáng)力達(dá)霉素對卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂作用
　　 力達(dá)霉素殺傷腫瘤最主要是通過切割DNA，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂。我們借助γH2AX水平來了解細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈斷裂的程度，通過Western blot和免疫熒光

10、實驗可以看到，γH2AX在力達(dá)霉素和格爾德霉素聯(lián)合應(yīng)用的情況下細(xì)胞內(nèi)的γH2AX明顯增加，尤其是細(xì)胞核內(nèi)的γH2AX水平，說明格爾德霉素的聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)力達(dá)霉素的DNA斷裂能力。
　　 五、Hsp90抑制劑增強(qiáng)力達(dá)霉素對卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的殺傷作用是通過抑制力達(dá)霉素誘導(dǎo)的DNA損傷后修復(fù)實現(xiàn)的
　　 在用0.05 nM力達(dá)霉素處理細(xì)胞1小時后，細(xì)胞內(nèi)的γH2AX大量增加，說明在此期間細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的DNA雙鏈斷裂，

11、但6小時后γH2AX陽性細(xì)胞減少或細(xì)胞內(nèi)γH2AX染色程度減弱，細(xì)胞內(nèi)本來存在的雙鏈斷裂減少了；而用格爾德霉素預(yù)處理的細(xì)胞內(nèi)的γH2AX沒有發(fā)生大的變化，所以格爾德霉素的預(yù)處理可以抑制由力達(dá)霉素誘導(dǎo)的DNA損傷后修復(fù)。
　　 六、Hsp90抑制劑可以抑制力達(dá)霉素誘導(dǎo)的G2/M期阻滯
　　 不同劑量力達(dá)霉素處理SKOV-3細(xì)胞24h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布變化。結(jié)果顯示，力達(dá)霉素誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，

12、該作用呈劑量相關(guān)。隨著力達(dá)霉素濃度增加，G2/M期細(xì)胞比例逐漸增加。
　　 用不同劑量的格爾德霉素預(yù)處理細(xì)胞16小時，再用不同劑量的力達(dá)霉素處理細(xì)胞24小時，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。在SKOV-3細(xì)胞中，0.05 nM力達(dá)霉素處理細(xì)胞可以使G2/M期細(xì)胞從15.28％增加到76.79％，而經(jīng)過200nM格爾德霉素預(yù)處理細(xì)胞G2/M期百分比大大下降，從76.79％下降到29.33％。說明格爾德霉素可以抑制力達(dá)霉素在SKOV-

13、3細(xì)胞中誘導(dǎo)的G2/M期細(xì)胞周期阻滯。
　　 七、Hsp90抑制劑可以降低某些與基因組穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白或抑制其活性
　　 Western blot分析Hsp90抑制劑可以抑制多種與基因組穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白水平或抑制其活性，其中包括ATM、ATRIP、BRCA1、RPA70。其中，ATRIP的總蛋白水平的下降可以被蛋白酶體抑制劑MG132的作用所阻斷。
　　 結(jié)論：
　　 本研究首次研究了Hsp90抑制劑對烯