RNA干擾技術阻斷PTEN表達對體外活化肝星狀細胞細胞周期的影響.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是各種不同致病因子引起慢性肝病進而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑，是肝臟對各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復反應。其主要病理改變是細胞外間質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度合成與異常沉積。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝臟主要的纖維生成細胞，其活化后可在肝損傷部位移行、增殖，表達各種信號轉(zhuǎn)導蛋白，產(chǎn)生大量以膠原為主的ECM成分

2、和細胞因子，是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。隨著對肝纖維化發(fā)病機制的深入研究，如何抑制HSC活化、增殖，進而減少ECM合成，已成為目前阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略。
　　 第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase andtensin homology deleted on chromosome Ten，PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，可負性調(diào)控腫瘤細胞細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖、

3、誘導腫瘤細胞凋亡，其缺失或表達異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。
　　 近年來，對PTEN的研究已從腫瘤領域逐漸延伸到非腫瘤領域。研究發(fā)現(xiàn)，特異性肝細胞PTEN缺失不僅引起肝細胞癌，還導致與肝纖維化密切相關的非酒精性肝炎的發(fā)生。而我們的前期研究表明，在膽總管結扎肝纖維化大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA表達均低于正常大鼠肝組織并與在體HSC的活化、增殖呈顯著負相關；進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達的PTEN可顯著抑制體外活化HSC的增殖、

4、誘導其凋亡，并且PTEN過表達可通過下調(diào)活化HSC的cyclinD1、CDK4蛋白及其mRNA表達，上調(diào)P27kipl蛋白及其mRNA表達負性調(diào)控活化HSC的細胞周期進程。但PTEN低表達對體外活化HSC細胞周期的影響仍不清楚。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是目前最有效的基因沉默技術，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而下調(diào)相應蛋白水平及功能。為此，我們在前期研究的基礎上，構建了靶向PTEN的RNA干

5、擾重組腺病毒(Ad-siRNA/PTEN)，并在體外感染活化的大鼠肝星狀細胞系HSC-T6，觀察阻斷PTEN表達對活化HSC細胞周期的影響，從反面探討PTEN在調(diào)控HSC生物學行為中的作用，以期從細胞周期角度揭示PTEN調(diào)控HSC增殖的機制，從而為尋找抗肝纖維化治療的有效新靶點提供實驗及理論依據(jù)。
　　 目的：采用RNAi技術，以腺病毒為載體，構建靶向PTEN的RNA干擾重組體，觀察阻斷PTEN表達對活化HSC細胞周期的影響及其

6、信號轉(zhuǎn)導機制。
　　 方法：利用AD293T細胞擴增實驗所需的腺病毒(Ad-SiRNA/PTEN、Ad-EGFP)，熒光顯微鏡檢測病毒滴度，并在體外感染活化的大鼠肝星狀細胞系HSC-T6。實驗分組如下：①Control組，僅以含8％胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，在轉(zhuǎn)染步驟加入無血清無抗生素DMEM代替病毒液；②Ad-EGFP組，轉(zhuǎn)染表達增強型綠色熒光蛋白(Enhanced greenfluorescent protein

7、，EGFP)的空病毒Ad-EGFP;⑧Ad-siRNA/PTEN組，轉(zhuǎn)染靶向PTEN的RNA干擾序列并表達EGFP的重組腺病毒Ad-siRNA/PTEN。
　　 流式細胞術測定HSC細胞周期時相；Western blot檢測HSC的PTEN、細胞周期素D1(cyclinD1)、細胞周期素依賴性激酶4(cyclin dependentkinase4，CDK4)、細胞周期素依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kin

8、aseinhibitor，CDI)之一的P27kipl、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B(serine-threonineprotein kinase B，Akt)、p-Akt(Thr308)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulated kinase，ERK)及p-ERK蛋白表達情況。
　　 結果：①通過反復感染AD293T細胞的方法使病毒擴增獲得了實驗所需的病毒液(Ad-siRNA/PTEN、Ad-

9、EGFP的滴度分別為1.1×109pfu/mL、1.2×109pfu/mL)。②腺病毒感染HSC后，應用Western blot分析隨感染時間延長，HSC內(nèi)PTEN蛋白的動態(tài)表達，結果顯示，在0h、24h、48h及72h時，細胞內(nèi)PTEN蛋白表達分別為2.46±0.06、1.78±0.04、1.43±0.12及0.79±0.14(P＜0.01)。在感染后72h，同Ad-EGFP組(1.18±0.05)相比，Ad-siRNA/PTEN組(

10、0.43±0.02)PTEN蛋白表達顯著降低，P＜0.01;而Control組(1.23±0.17)與Ad-EGFP組之間無明顯差異（P＞0.05）。③流式細胞儀檢測結果顯示，HSC細胞數(shù)G0/G]期所占比例，Ad-siRNA/PTEN組(57.70％±4.37％)較Control組（68.13％±1.00％）及Ad-EGFP組（69，57％±2.15％）明顯降低(P＜0.01)；S期所占比例，Ad-siRNA/PTEN組（30.70％

11、±5.13％）較Control組（13.13％±1.78％）及Ad-EGFP組(12.37％±1.33％)明顯增高(P＜0.01);G2/M期所占比例，Ad-siRNA/PTEN組（11.60％±2.72％）低于Control組（18.73％±2.78％）及Ad-EGFP組(18.40％±2.79％)(P＜0.01);Control組與Ad-EGFP組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0，05）。④腺病毒感染HSC后72h，Western bl

12、ot分析各組HSCcyclinD1蛋白表達，Ad-siRNA/PTEN組(2.78±0.18)較Control組(1.93±0.12)及Ad-EGFP組(1.87±0.03)顯著增高(P＜0.01)；而Control組與Ad-EGFP組之間無明顯差異(P＞0.05）。⑤腺病毒感染HSC后72h，Western blot檢測各組HSC CDK4蛋白表達，Ad-siRNA/PTEN組(0.49±0.01)較Control組(0.41±0.0

13、1)及Ad-EGFP組(0.39±0.02)增加(P＜0.01);Control組與Ad-EGFP組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。⑥腺病毒感染HSC后72h，Westernblot分析各組HSC P27kipl蛋白表達，Ad-siRNA/PTEN組(1.57±0.03)低于Control組(1.91±0.03)及Ad-EGFP組(1.95±0.02)，P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間無明顯差異（P＞0.05）

14、。⑦腺病毒感染HSC后72h，Westernblot分析各組HSC Akt蛋白表達，Ad-siRNA/PTEN組(2.71±0.22)低于Control組（3.4±0.16）及Ad-EGFP組(3.39±0.38)，P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間無明顯差異(P＞0.05）。⑧腺病毒感染HSC后72h，Westernblot分析各組HSCp-Akt(Thr308)蛋白表達，Ad-siRNA/PTEN組(2.27±0.

15、02)高于Control組(1.69±0.01)及Ad-EGFP組(1.74±0.01)，P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間p-Akt(Thr308)表達無顯著差別（P＞0.05）。⑨腺病毒感染HSC后72h，Western blot分析各組HSC ERK蛋白表達，Ad-siRNA/PTEN組(0.37±0.03)低于Control組(0.48±0.04)及Ad-EGFP組(0.54±0.04)，P＜0.01;Cont

16、rol組與Ad-EGFP組之間無顯著差別（P＞0.05）。⑩腺病毒感染HSC后72h，Western blot分析各組HSCp-ERK蛋白表達顯示Ad-siRNA/PTEN組(4.47±0.08)高于Control組(3.29±0.08)及Ad-EGFP組(3.36±0.04)，P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間p-ERK表達無顯著差異（P＞0.05）。
　　 結論：重組腺病毒Ad-siRNA/PTEN及空病毒