重組南瓜胰蛋白酶抑制劑Ⅰ的分離純化及活性研究.pdf

1、南瓜胰蛋白酶抑制劑Ⅰ(Cucurbita maxima trypsin inhibitor Ⅰ，CMTI-Ⅰ)是一種來源于南瓜籽的經(jīng)典類絲氨酸蛋白酶抑制劑，該家族由20多種成員組成。CMTI的成員分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、作用機制清楚，是研究活性蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及作用機制的良好工具。由于CMTI家族各成員在分子量和結(jié)構(gòu)方面相近，目前很難從南瓜籽中分離純化出大量單一CMTI，從而限制了其藥用開發(fā)研究。為此，我室構(gòu)建了表達(dá)重組CMTI-Ⅰ

2、(rCMTI-Ⅰ)的GS115畢赤酵母工程菌。為了對rCMTI-Ⅰ進行深入的研究與開發(fā)，本論文研究制備了以微晶纖維素為固定化介質(zhì)的rCMTI-Ⅰ親和純化介質(zhì)，建立了rCMTI-Ⅰ的分離純化工藝，研究了rCMTI-Ⅰ對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，并研究了rCMTI-Ⅰ對明膠酶的作用。研究內(nèi)容與結(jié)果主要有以下幾個方面。 1.rCMTI-Ⅰ親和層析介質(zhì)的制備 首先用環(huán)氧氯丙烷活化柱層析用微晶纖維素，并以胰蛋白酶為配基交聯(lián)于其上獲得了親

3、和層析介質(zhì)，同時考察了微晶纖維素的最佳活化條件以及制備微晶纖維素親和層析介質(zhì)最佳胰蛋白酶用量。最佳活化條件為1:1的2.4mol/LNaOH溶液與DMSO(體積比)作為混合溶劑，活化溫度為30℃，活化時間3h環(huán)氧氯丙烷的用量為20ml/g時環(huán)氧基密度最大。在最佳活化條件下，每克微晶纖維素的環(huán)氧基含量為(302.4908±10)μmol/g。 2.rCMTI-Ⅰ分離純化工藝的研究 用所制備的親和層析介質(zhì)從含有rCMTI-Ⅰ

4、的培養(yǎng)基上清中直接分離純化rCMTI-Ⅰ。通過SephadexG-10層析對獲得的親和層析洗脫液冷凍干燥品進行脫鹽，再用SephadexG-25層析進一步純化，采用Tricine-SDSPAGE以及抑制活力測定對活性蛋白峰進行追蹤，獲得了基本純化的rCMTI-Ⅰ。與用陽離子交換劑和陰離子交換劑作為純化介質(zhì)相比，親和層析介質(zhì)純化效果較好。 3.rCMTI-Ⅰ對腫瘤細(xì)胞增殖的影響 研究了rCMTI-Ⅰ對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，發(fā)

5、現(xiàn)rCMTI-Ⅰ對卵巢癌SKOV3細(xì)胞和SE-2腫瘤細(xì)胞的增殖有非常明顯的抑制作用，并且這種抑制呈明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系，在濃度為3.82×10-2μmol/ml時rCMTI-Ⅰ對兩種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率分別為69.3％和86.5％。本結(jié)果預(yù)示著rCMTI-Ⅰ有抗腫瘤作用。 4.rCMTI-Ⅰ對腫瘤細(xì)胞增殖的影響 采用琥珀酰明膠法測定rCMTI-Ⅰ對明膠酶的作用，顯示rCMTI-Ⅰ具有抑制明膠酶的活性，揭示rCMTI-Ⅰ可

6、能具有抑制明膠酶降解基底膜抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。 本研究取得的主要研究成果有： (1)研究制備了偶聯(lián)有胰蛋白酶的柱層析用微晶纖維素親和層析介質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上研究建立了從工程菌發(fā)酵表達(dá)的上清液中分離純化rCMTI-Ⅰ的工藝，該工藝適合規(guī)?；a(chǎn)。 (2)研究發(fā)現(xiàn)rCMTI-Ⅰ具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，揭示rCMTI-Ⅰ可能具有抗腫瘤作用。 (3)采用琥珀酰明膠法測定rCMTI-Ⅰ對明膠酶的作用，顯示rCMT