牡蠣（Crassostrea gigas）胰蛋白酶抑制劑的制備及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、本論文較系統(tǒng)地研究了牡蠣胰蛋白酶抑制劑(oyster trypsin inhibitor，OTI)的制備、分離純化方法及其部分性質(zhì)和抗腫瘤活性，為進(jìn)一步探討胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了一個(gè)新途徑。 本文包括以下6個(gè)部分研究?jī)?nèi)容： 1．利用胰蛋白酶對(duì)底物BAEE的催化水解產(chǎn)物在波長(zhǎng)253 nm處有紫外吸收的原理，建立了胰蛋白酶抑制活性的測(cè)定方法。以抑制率為50％時(shí)的抑制比活

2、力即IUM值，作為分離純化時(shí)的活性篩選指標(biāo)。 2．以熱變性沉淀法和兩次硫酸銨沉淀法處理牡蠣原料，冷凍干燥得到OTI粗品，得率為17.98％，蛋白含量為56.51％，IUM值為6.58 U/mg。此法簡(jiǎn)單可行、成本低廉、安全性高。 3．OTI粗品經(jīng)Sephadex G-75凝膠層析得到兩個(gè)吸收峰，第一個(gè)峰A1峰有抑制活性，其IUM值為47.43 U/mg。A1峰經(jīng)胰蛋白酶-Sepharose 4B親和層析只得到一個(gè)結(jié)合

3、峰A1B峰，其IUM值為270.74 U/mg。在進(jìn)行親和層析之前，需要成功地將胰蛋白酶與溴化氰活化的Sepharose 4B填料干粉相偶聯(lián)。將A1B1峰用Sephadex G-15凝膠層析脫鹽，得到兩個(gè)吸收峰，第二個(gè)峰A1BC2峰有抑制活性，其IUM值為299.54 U/mg。收集A1B1C2峰，濃縮凍干，得到制備的OTI凍干粉。粗品經(jīng)過(guò)三步的分離純化后，純化倍數(shù)達(dá)到45.52，活性回收率為19.94％。 4．采用MTT法，

4、測(cè)定OTI對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞和人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制生長(zhǎng)作用，同時(shí)以抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶作為藥物對(duì)照。結(jié)果表明，OTI對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)都有一定的抑制作用，抑制率分別為20.78±2.37％和20.68±2.14％。同時(shí)，OTI對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用要高于對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，且抑制率都為同劑量抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶的50％左右。 5．采用高效反相液相色譜法純化出OTI的抗腫瘤活性成分。

5、先用C<,18>半制各柱純化，得到兩個(gè)吸收峰，第二個(gè)峰Y2峰有抑制活性，其IUM值為373.31 U/mg。將Y2峰用C<,18>分析柱繼續(xù)純化并鑒定純度，只洗脫出一個(gè)吸收峰Y2F峰，其IUM值為380.84 U/mg。分析柱的單峰說(shuō)明，Y2F峰具有較高的純度和活性，因此將其作為OTI的抗腫瘤活性成分，命名為OTIA。 6．對(duì)OTIA的部分性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。OTIA具有很好的熱穩(wěn)定性，在20-100℃的溫度范圍內(nèi)都有胰蛋白酶抑制活

6、性；OTIA也具有很好的pH穩(wěn)定性，在pH 2.0-12.0的范圍內(nèi)都有胰蛋白酶抑制活性。 采用高效排阻液相色譜法(HPSEC)測(cè)得OTIA的分子量是5.036 kDa。OTIA對(duì)胰蛋白酶的摩爾抑制比近似為1:2，推斷其為雙頭抑制劑，屬于Bowman-Birk類抑制劑。 從抑制動(dòng)力學(xué)的Lineweaver-Burk圖可以得知，胰蛋白酶與底物BAEE反應(yīng)的米氏常數(shù)Km值為1.211 mmol/l，OTIA的抑制常數(shù)胞值