大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑MALDITOF分析方法研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因大豆在我國(guó)飼料、食用油原料中使用量的不斷增加，轉(zhuǎn)基因大豆帶來(lái)的食品安全問(wèn)題成為廣大消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。大豆胰蛋白酶抑制劑是影響大豆食用安全性的主要物質(zhì)，外源基因轉(zhuǎn)入后是否會(huì)使大豆中胰蛋白酶抑制劑的組成發(fā)生變化，這種變化是否會(huì)帶來(lái)新的安全問(wèn)題，目前還是未知數(shù)。但是由于目前缺乏很好的分析方法，因此這方面的相關(guān)研究基本上沒(méi)有開(kāi)展。
　　針對(duì)上述問(wèn)題，本論文通過(guò)研究比較胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶解效果，確定了以胰凝乳蛋白酶為主要的

2、水解酶，在37℃恒溫下水解16h的大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑的基本水解條件，建立了大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑酶解肽段的MALDI-TOF-MS分析方法。MALDI-TOF-MS儀器條件為離子源1加速電壓為25 kV，離子源2加速電壓為22 kV，能量85 ev，N2激光波長(zhǎng)為337 nm，脈沖寬度為5 ns，離子延遲提取500 ns，真空度5×10-9 Pa，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次，正離子反射模式下測(cè)定。使用基質(zhì)峰進(jìn)行內(nèi)

3、部校正，使用多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行外部校準(zhǔn)。經(jīng)胰凝乳蛋白酶水解得到大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑肽段采用改進(jìn)后的雙層干燥法（第一層為基質(zhì)HCCA層，第二層為kunitz型胰蛋白酶抑制劑層）上樣1μL，經(jīng)過(guò)MALDI-TOF-MS檢測(cè)得到的肽質(zhì)量指紋圖譜與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑家族的保守域序列進(jìn)行對(duì)比，得到該非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑的序列覆蓋率分別為21％和8％，得到的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大