Ad-HGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療兔肢體缺血的實驗研究.pdf

1、研究背景
　　 目前治療性血管新生主要有兩種方法，一是局部缺血區(qū)域注射外源性血管生長因子蛋白或基因，二是局部缺血組織移植具有多向分化潛能的干細(xì)胞，干細(xì)胞在缺血缺氧狀態(tài)下分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞并產(chǎn)生促血管生長因子來進一步促進血管新生。
　　 在基因工程范疇內(nèi)聯(lián)合基因治療和細(xì)胞治療，應(yīng)用基因修飾的干細(xì)胞促進血管新生是一種極具前景的治療手段。HGF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以將治療性蛋白HGF轉(zhuǎn)入缺血的組織中以滿足基因治療的特定

2、需要，安全性更高;它在體內(nèi)同時發(fā)揮治療性原材料和持續(xù)輸送促血管新生的生長因子HGF兩種作用，與單純的干細(xì)胞治療或基因治療相比更具優(yōu)越性。本課題分三部分，依次探討以下問題:(1)研究兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定方法。(2)利用腺病毒載體將肝細(xì)胞生長因子轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染對細(xì)胞生物學(xué)特性有無影響，ELISA及免疫組化檢測轉(zhuǎn)染后外源基因HGF的表達(dá)。(3)制備兔后肢缺血模型，HGF基因修飾的BMSCs

3、移植與單純BMSCs移植或HGF基因治療在兔后肢缺血模型中的促血管新生作用及其機制。
　　 第一部分:兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:研究兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定方法，觀察其生物學(xué)特性。
　　 方法:穿刺股骨采集兔骨髓血，應(yīng)用淋巴分離液密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過觀察細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物以及對其進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，對培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行鑒定。

4、
　　 結(jié)果:應(yīng)用淋巴分離液密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選培養(yǎng)法得到純化的BMSCs。通過本方法培養(yǎng)得到的BMSCs貼壁生長，呈典型的長梭形，漩渦狀排列;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44表達(dá)陽性，CD11b、CD45表達(dá)陰性;細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化后Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性，以上這些結(jié)果符合文獻(xiàn)報道的BMSCs特征。
　　 結(jié)論:密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選培養(yǎng)可以有效的體外擴增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得高度純化的骨髓間充

5、質(zhì)干細(xì)胞。
　　 第二部分:Ad-HGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及體外檢測
　　 目的:利用重組腺病毒載體將肝細(xì)胞生長因子轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測基因轉(zhuǎn)染效率，ELISA及免疫組化檢測轉(zhuǎn)染后外源基因HGF的表達(dá)。
　　 0方法:攜帶HGF基因和綠色熒光蛋白(greenfluoresceneprotein，GFP)的重組腺病毒(adenovirus)載體Ad-HGF、Ad-GFP，均由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院哈小

6、琴教授提供。以不同MOI值(multipleofinfection，感染復(fù)數(shù))的Ad-GFP病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs，流式細(xì)胞檢測表達(dá)GFP陽性的細(xì)胞率。以MOI=150的Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs，ELISA檢測及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HGF表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測HGF-BMSC細(xì)胞表面標(biāo)志物以及誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以確定基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生物學(xué)特性有無變化;同時transwell檢測HGF介導(dǎo)BMSCs細(xì)胞遷移能力。
　　 結(jié)果:Ad-GFP以不

7、同的MOI轉(zhuǎn)染兔BMSCs48h后，表達(dá)GFP的陽性細(xì)胞率有顯著性差異(P＜0.05);MOI=150時表達(dá)GFP陽性的細(xì)胞率達(dá)98％以上，MOI大于150以上時，表達(dá)GFP陽性的細(xì)胞率無顯著性差異(P＞0.05);因此選擇MOI=150轉(zhuǎn)染BMSCs。將Ad-HGF以MOI=150轉(zhuǎn)染兔BMSCs后，ELISA及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示:細(xì)胞培養(yǎng)上清及胞漿內(nèi)有豐富的HGF蛋白表達(dá)，表明Ad-HGF可高效轉(zhuǎn)染BMSCs，BMSCs有HG

8、F蛋白的高表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測及誘導(dǎo)分化培養(yǎng)結(jié)果顯示:腺病毒感染以及HGF基因修飾不改變BMSC表型和分化潛能。同時實驗結(jié)果顯示HGF對BMSC有極強的趨化作用。
　　 結(jié)論:Ad-GFP可成功轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以MOI=150轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)98％以上，轉(zhuǎn)染24h即可見綠色熒光，2-4天轉(zhuǎn)染率最高;表明重組腺病毒作為載體轉(zhuǎn)染BMSCs具有高轉(zhuǎn)染率與穩(wěn)定表達(dá)。肝細(xì)胞生長因子腺病毒表達(dá)載體Ad-HGF轉(zhuǎn)染骨髓

9、間充質(zhì)干細(xì)胞不改變BMSCs的固有特性;經(jīng)ELISA及免疫組化檢測，BMSCs可高表達(dá)HGF蛋白。HGF對BMSC有明顯的趨化作用。
　　 第三部分:肝細(xì)胞生長因子基因修飾的骨髓間充質(zhì)千細(xì)胞移植治療兔肢體缺血
　　 目的:比較HGF基因修飾的BMSCs移植與單純BMSCs移植或HGF基因治療在兔后肢缺血模型中的促血管新生作用及其機制探討。
　　 方法:后肢缺血的新西蘭大白兔模型隨機分為四組，每組10只，治療方法:

10、a.空腺病毒對照組（Ad-GFP組）:缺血部位肌肉多點注射1×109PfuAd-GFP。b.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC組）組:缺血部位肌肉多點注射1×107個骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。c.HGF基因治療組(Ad-HGF組):缺血部位肌肉多點注射1×109PfuAd-HGF。d.轉(zhuǎn)染HGF的BMSC治療組(HGF-BMSC組):缺血部位肌肉多點注射1×107個轉(zhuǎn)染HGF的BMSC。移植后28天行動脈造影及側(cè)枝血管計數(shù);免疫組織化學(xué)檢測缺血區(qū)域毛細(xì)

11、血管密度;免疫熒光檢測BMSCs在體內(nèi)的分布及分化;Western-blot檢測組織中HGF、C-met蛋白的表達(dá);ELISA檢測移植前后兔血清中HGF的濃度。
　　 結(jié)果:造影結(jié)果顯示骨髓干細(xì)胞組（BMSC組）、HGF基因治療組(Ad-HGF組)及HGF-BMSC組血管數(shù)明顯高于空腺病毒對照組(P＜0.05);HGF-BMSC組的側(cè)支血管計數(shù)最高。移植后Ad-GFP標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞散在分布于各肌纖維的間質(zhì)中，呈現(xiàn)明亮的綠

12、色熒光。在細(xì)胞移植后3周，部分Ad-GFP標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31。Westernblot結(jié)果顯示，骨髓干細(xì)胞組（BMSC組）、HGF基因治療組（Ad-HGF組）及HGF-BMSC組HGF表達(dá)明顯高于空腺病毒對照組(P＜0.05)，以HGF-BMSC組的HGF表達(dá)最高。ELISA結(jié)果顯示，HGF-BMSC移植前和移植后1周時，兔血清HGF的濃度無明顯變化(P＞0.05)
　　 結(jié)論:與單純的BMSC細(xì)胞移