神經(jīng)突起誘向因子（Netrin-4）受體的初步研究.pdf

1、目的：神經(jīng)突起生長(zhǎng)誘向因子Netrin是一種分泌蛋白，在神經(jīng)發(fā)育所需的軸突誘向及細(xì)胞遷移中發(fā)揮雙重誘向功能——吸引或排斥，主要依賴(lài)于生長(zhǎng)錐所表達(dá)的不同受體結(jié)直腸癌缺失蛋白(DCC)或UNC5同源物(UNC5H)，從而傳遞不同信息。本課題組在從事4～6月孕齡人胎肝cDNA文庫(kù)大規(guī)模測(cè)序中發(fā)現(xiàn)一種新基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析確認(rèn)為Netrin家族成員，即Netrin-4[1]，已有研究證明Netrin-4具有軸突誘向功能，但尚未明確其受體及信號(hào)

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究探討了神經(jīng)突起生長(zhǎng)誘向因子Netrin-4的受體以及Netrin-1已知受體DCC和UNC5H1作為Netrin-4受體的可能性，為從蛋白水平研究其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及生物學(xué)功能提供依據(jù)。 方法：構(gòu)建真核表達(dá)載體AP4-Netrin-4、AP4-Netrin-1，轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞以獲得含有堿性磷酸酶(AP)的融合蛋白。改良Koh法分離、原代培養(yǎng)出生12h內(nèi)清潔級(jí)Wistar乳鼠的嗅球及皮層神經(jīng)元，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法

3、鑒定其純度。AP4-Netrin-4融合蛋白與原代培養(yǎng)第7d的神經(jīng)元孵育，以親和細(xì)胞化學(xué)法及堿性磷酸酶原位顯色間接反映Netrin4受體在神經(jīng)元的定位(因?yàn)樵撊诤系鞍啄芎蚇etrin-4受體在細(xì)胞表面發(fā)生親和反應(yīng)，從而可用堿性磷酸酶顯色進(jìn)行檢測(cè))。以AP4-Netrin-4為配體，以編碼DCC和UNC5H1的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞為對(duì)象，采用親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)DCC、UNC5H1作為Netrin-4受體的可能性。再以原代培養(yǎng)神經(jīng)

4、元為對(duì)象，檢測(cè)受體結(jié)合動(dòng)力學(xué)、受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合動(dòng)力學(xué)。 結(jié)果：原代培養(yǎng)第7d的嗅球及皮層神經(jīng)元胞體飽滿(mǎn)，突起長(zhǎng)并交織成網(wǎng)狀；免疫細(xì)胞化學(xué)染色見(jiàn)神經(jīng)絲蛋白(neurofilament)在神經(jīng)元胞體及突起中表達(dá)；嗅球及皮層神經(jīng)元的細(xì)胞膜上均有Netrin-4受體表達(dá)。轉(zhuǎn)染已知Netrin-1受體DCC和UNC5H1的COS7細(xì)胞既能與Netrin-1，也能與Netrin-4結(jié)合；受體結(jié)合飽和實(shí)驗(yàn)顯示配體與受體呈快速結(jié)合(15min達(dá)高