神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75NTR抑制肝癌生長(zhǎng)的機(jī)制研究.pdf

1、p75NTR(p75neurotrophinreceptor)是神經(jīng)生長(zhǎng)因子(neurotrophin,NT)的低親和力受體，由427個(gè)氨基酸組成，屬于腫瘤壞死因子受體超家族(TNFR)的一員。p75NTR不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起重要作用，而且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用。
　　既往的研究表明，p75NTR是一個(gè)潛在的抑癌基因，它可以抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而有報(bào)道認(rèn)為p75NTR也可以作為生存受體促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移，這

2、一矛盾提示p75NTR在不同的腫瘤中可能發(fā)揮了不同的作用。我科先前的研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR在胃癌中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，p75NTR可以抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。迄今為止，p75NTR在肝癌中的表達(dá)情況及在肝癌生長(zhǎng)中的作用尚不清楚，本課題將對(duì)此進(jìn)行探討。
　　【目的】
　　1、研究p75NTR在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)情況；2、研究p75NTR對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；3、探討p75NTR誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯的可能機(jī)制。
　　

3、【方法】
　　1、利用免疫組化方法研究p75NTR在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)。2、WesternBlot方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系中p75NTR的表達(dá)。3、通過(guò)基因重組方法構(gòu)建p75NTR的siRNA載體，轉(zhuǎn)染Chang細(xì)胞，G418篩選，獲得穩(wěn)定克隆。構(gòu)建p75NTR的正義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，G418篩選，獲得穩(wěn)定克隆。4、對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞利用Westernblot技術(shù)鑒定不同載體的轉(zhuǎn)染效果。5、MTT法繪制轉(zhuǎn)染細(xì)

4、胞及對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。6、流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。7、利用Hoechst33258染色法和流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡百分率。8、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞在體外的成瘤能力。9、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。10、用Westernblot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)分子表達(dá)水平的變化。
　　【結(jié)果】
　　1、利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了p75NTR在肝癌和癌旁組織

5、中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p75NTR在肝癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，肝癌的分化程度越低、臨床分期越差則p75NTR的表達(dá)也越低。2、WesternBlot方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系中p75NTR蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p75NTR在正常肝細(xì)胞系中表達(dá)較高，而在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)較低。3、構(gòu)建了p75NTR的siRNA載體，將其轉(zhuǎn)染Chang細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆，經(jīng)蛋白水平檢測(cè)證實(shí)成功建立了p75NTR下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞系。同時(shí)構(gòu)建了p

6、75NTR的正義表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆，經(jīng)蛋白水平檢測(cè)證實(shí)成功建立了p75NTR上調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞系。4、用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p75NTR-siRNA轉(zhuǎn)染的Chang細(xì)胞生長(zhǎng)加快，而p75NTR正義轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)減慢。5、細(xì)胞周期檢測(cè)顯示，p75NTR-siRNA轉(zhuǎn)染的Chang細(xì)胞增殖指數(shù)增加，G1/S期的轉(zhuǎn)換加快；而p75NTR正義轉(zhuǎn)染的的HepG2細(xì)胞增殖指數(shù)降低，

7、發(fā)生G1/S期的阻滯。6、Hoechst33258染色法和流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p75NTR正義轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞的凋亡百分率增加。7、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，p75NTR正義轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，克隆形成率顯著低于對(duì)照細(xì)胞。8、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p75NTR正義轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞的成瘤性顯著低于對(duì)照細(xì)胞。9、Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)分子發(fā)現(xiàn)，p75NTR表達(dá)的下調(diào)

8、使PCNA、CyclinD1和p-Rb的表達(dá)上調(diào)，但使Rb的表達(dá)下調(diào)；p75NTR表達(dá)的上調(diào)使PCNA、CyclinD1和p-Rb的表達(dá)下調(diào)，但使Rb的表達(dá)上調(diào)。這提示p75NTR通過(guò)上述機(jī)制引起了G1/S期的阻滯。
　　【結(jié)論】
　　1、p75NTR在肝癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，肝癌的分化程度越低、臨床分期越差則p75NTR的表達(dá)就越低。2、p75NTR可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，從而抑制了肝癌細(xì)胞的