經(jīng)典MHC Ⅰ類分子對(duì)原代皮層神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的影響及機(jī)制的初步探究.pdf

1、近年報(bào)道多種在免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并起重要作用的蛋白質(zhì)，在發(fā)育及成年神經(jīng)系統(tǒng)也有表達(dá)。其中，經(jīng)典MHCⅠ類分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)和功能逐漸成為神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)免疫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。該分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈時(shí)空特異性的表達(dá)，提示該分子可能存在重要功能。目前已知該分子可改變突觸的可塑性。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí):小鼠出生后早期（P4天），即突觸發(fā)育高峰期前，大腦皮層神經(jīng)元存在MHCⅠ類分子的表達(dá);與野生型相比，MHCⅠ類分子敲除鼠體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元突起數(shù)

2、目增加。這些結(jié)果表明MHCⅠ類分子在突觸形成前已在小鼠皮層神經(jīng)元中表達(dá)，且可能參與神經(jīng)突起的形成?；谇捌诘难芯拷Y(jié)果，選取C57BL/6野生小鼠和MHCⅠ類分子基因敲除小鼠，運(yùn)用原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，通過病毒感染、抗體阻斷、免疫熒光、Western Blot、RT-qPCR等方法探究經(jīng)典MHCⅠ類分子與神經(jīng)元突起形成的相關(guān)性及調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.在C57BL/6野生型小鼠原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元突起形成的早期(1-2

3、DIV)、樹突和軸突分化的高峰期(4-5 DIV)以及樹突生長(zhǎng)的高峰期(7-10 DIV)，利用MHCⅠ類分子特異性的抗體(OX18)和細(xì)胞骨架F-actin特異性的染料（鬼筆環(huán)肽）進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果顯示在神經(jīng)突起生長(zhǎng)的三個(gè)關(guān)鍵期，經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)于神經(jīng)元的胞體、樹突以及生長(zhǎng)錐部位，且在神經(jīng)突起形成處和生長(zhǎng)錐部位與細(xì)胞骨架分子F-actin共標(biāo)。提示在突觸形成前，經(jīng)典MHCⅠ類分子已在小鼠皮層神經(jīng)元中表達(dá)，且可能參與神經(jīng)突

4、起的形成。
　　2.原代培養(yǎng)C57BL/6野生型和MHCⅠ類分子敲除小鼠（H2-DbKb-/-小鼠）的皮層神經(jīng)元。通過病毒載體在敲除小鼠的皮層神經(jīng)元過表達(dá)MHCⅠ類分子，可抑制神經(jīng)突起的形成。在C57BL/6野生型小鼠原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中加入MHCⅠ類分子的特異性抗體(OX18)、PirB的抗體和胞外段。Sholl analysis定量分析顯示，在阻斷信號(hào)通路后，皮層神經(jīng)元突起數(shù)目和總長(zhǎng)度明顯增加。提示在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，經(jīng)典

5、MHCⅠ類分子可抑制神經(jīng)突起的生長(zhǎng)。
　　3.原代培養(yǎng)C57BL/6野生型小鼠的皮層神經(jīng)元，利用MHCⅠ類分子的特異性抗體(OX18)阻斷MHCⅠ類分子相關(guān)信號(hào)通路，利用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞骨架相關(guān)分子的表達(dá)。結(jié)果顯示細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白Cofilin的磷酸化水平下調(diào)，調(diào)控該蛋白的蛋白激酶LIMK1的磷酸化水平也同步下調(diào)。加入PirB的抗體或其胞外段阻斷相關(guān)信號(hào)通路與加入MHCⅠ類分子的抗體阻斷信號(hào)通路后對(duì)Cofilin的

6、影響相似，間接表明MHCⅠ可能與PirB相互作用引起細(xì)胞骨架相關(guān)分子的變化，從而改變神經(jīng)突起的形態(tài)。
　　4.原代培養(yǎng)C57BL/6野生型和MHCⅠ敲除小鼠的皮層神經(jīng)元，通過RT-qPCR檢測(cè)神經(jīng)突起發(fā)育相關(guān)基因GAP43、GPRIN1、STMN2在mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示在MHCⅠ敲除小鼠體外培養(yǎng)6天的神經(jīng)元中，這三個(gè)基因在mRNA的表達(dá)水平明顯升高。提示調(diào)控MHGⅠ類分子的表達(dá)可影響神經(jīng)突起發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，可能間接改變

7、神經(jīng)突起的形態(tài)。
　　5.利用無Mg2+培養(yǎng)液誘導(dǎo)體外細(xì)胞癲癇模型，在誘導(dǎo)3h后換成正常的神經(jīng)元培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。Western blot結(jié)果顯示換上正常的培養(yǎng)液培養(yǎng)16h后，MHCⅠ類分子的表達(dá)升高。且免疫熒光的結(jié)果顯示，在用無Mg2+培養(yǎng)液誘導(dǎo)后，用正常的神經(jīng)元培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)8h、16h、24h后，樹突分支數(shù)目和總長(zhǎng)度均增加，在16h時(shí)，樹突分支增加的幅度最明顯。但在MHCⅠ敲除小鼠體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，用無Mg2+培養(yǎng)液誘導(dǎo)后