噴鼻流感三價裂解疫苗的制備和免疫效果的初步研究.pdf

1、自上世紀(jì)以來,人類歷史上曾四次發(fā)生流行性感冒的大流行。流感是由流感病毒引起的世界范圍的傳染性疾病,以損害呼吸系統(tǒng)為主,嚴(yán)重伴有主要并發(fā)癥,對人類的健康造成嚴(yán)重的威脅。在1918年爆發(fā)的“西班牙流感”疫情,造成近4000萬人的死亡。1957年及1968年爆發(fā)的兩次大流感,全球感染人數(shù)均高達(dá)30％,死亡人口超過30萬人。本世紀(jì)初出現(xiàn)的H5N1高致病性禽流感和2009年的甲型H1N1流感疫情,再次嚴(yán)重威脅人們的健康,其危害性日益得到人們的關(guān)注

2、與重視。
　　造成流感流行的主要原因是:流感病毒易發(fā)生抗原變異,且傳染性強(qiáng),傳播迅速,易發(fā)生大范圍流行。接種疫苗是目前有效防治流感的手段之一。現(xiàn)有的流感疫苗接種分為注射滅活疫苗與噴鼻活疫苗兩種,然而目前仍以注射免疫為主。但是注射疫苗接種方式繁瑣、不能產(chǎn)生有效的黏膜免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答效果、對于流感各亞型之間的交叉保護(hù)作用欠佳,而且對于特殊人群、如老人和兒童的免疫保護(hù)效果更加不能達(dá)到理想效果,這對流感的防控帶來極大的挑戰(zhàn)。噴鼻疫苗的出

3、現(xiàn)和飛速發(fā)展無疑為流感疫苗的研制及發(fā)展帶來了新的思路和發(fā)展空間。
　　已有研究表明,呼吸道黏膜是流感病毒感染機(jī)體的部位,也是機(jī)體對外源抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答、防御病原微生物感染的免疫器官。黏膜系統(tǒng)是人體抵御外界抗原入侵的第一道防線,鼻黏膜途徑的疫苗接種更接近于自然感染,且抗原用量較少,即能夠誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng)。噴鼻免疫能夠通過在黏膜的局部免疫引發(fā)系統(tǒng)免疫,從而加強(qiáng)病原體感染的免疫防御機(jī)制,提高了免疫的有效性,亦避免了注射免疫帶來的繁瑣

4、過程。噴鼻免疫的瓶頸問題在于其量效難以把握。噴鼻免疫過程中,黏膜免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性及處于免疫抑制占優(yōu)勢的狀態(tài)都可影響疫苗發(fā)揮作用,且疫苗進(jìn)入鼻腔以后會有少量進(jìn)入口腔和消化道,或流出體外。故此,噴鼻疫苗如何增效及量效關(guān)系,是噴鼻疫苗的研制中需要解決的重要問題。
　　本研究中,以殼聚糖、殼聚糖季銨鹽、殼聚糖水凝膠和殼聚糖季銨鹽水凝膠分別作為流感噴鼻疫苗的傳遞系統(tǒng),以甲型H1N1流感裂解病毒和甲型H1N1流感滅活全病毒作為待選抗原,以IL

5、-1β、IL-18、IL-33和可溶性ViE作為候選佐劑,制備不同噴鼻流感疫苗的組合物,通過動物實驗篩選噴鼻甲型H1N1流感疫苗的組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)殼聚糖季銨鹽水凝膠作為疫苗傳遞系統(tǒng)、IL-1β作為黏膜佐劑、甲型H1N1流感裂解病毒作為抗原時,所組成的組合物免疫效果最佳。進(jìn)一步通過在大腸桿菌中高效表達(dá)并分離純化了重組人IL-1β蛋白佐劑,并檢測其蛋白表達(dá)率、純度及生物活性。將rIL-1β蛋白作為作為甲型H1N1噴鼻流感裂
　　解疫

6、苗的佐劑免疫小鼠,評價其作為佐劑的有效性,由此進(jìn)行噴鼻流感三價裂解疫苗的制備和免疫效果的初步研究。
　　本研究主要包括以下三部分：
　　1、噴鼻流感疫苗傳遞系統(tǒng)、佐劑和抗原的篩選與確定。其研究進(jìn)展如下;
　　(1)噴鼻流感疫苗傳遞系統(tǒng)的篩選:以殼聚糖、殼聚糖季銨鹽、殼聚糖水凝膠和殼聚糖季銨鹽水凝膠為待選疫苗載體系統(tǒng),分別以甲型H1N1流感裂解病毒為疫苗抗原(4μg)與rIL-1β(2μg)制備噴鼻組合物流感疫苗,同時以

7、單抗原無佐劑組作為對照組,PBS組為空白組,分別免疫Balb/c小鼠,共免疫兩次,間隔時間為兩周。通過檢測小鼠血清中IgG效價、血抑效價(HI)和肺、鼻沖洗液中sIgA效價,初步評價其有效性。結(jié)果表明,殼聚糖季銨鹽水凝膠作為噴鼻疫苗傳遞系統(tǒng)的作用好于殼聚糖、殼聚糖季銨鹽和殼聚糖水凝膠,可有效誘導(dǎo)產(chǎn)生機(jī)體的體液免疫和黏膜免疫。在此基礎(chǔ)之上,對殼聚糖季銨鹽水凝膠的用量進(jìn)行篩選,制備不同濃度的水凝膠-抗原組合物,使水凝膠與抗原的比分別為1:1

8、、1:2和1:4,從結(jié)果可看出,當(dāng)水凝膠與抗原的比為1:1時,疫苗免疫效果最佳。
　　(2)噴鼻流感疫苗抗原的篩選：以甲型H1N1流感裂解病毒和滅活全病毒作為疫苗抗原,并分別以殼聚糖季銨鹽水凝膠作為疫苗傳遞系統(tǒng)(1:1)與rIL-1β(2μg)制備噴鼻組合物流感疫苗,分別免疫Balb/c小鼠,共免疫兩次,間隔時間為兩周。通過檢測小鼠血清中IgG效價、血抑效價(HI)和肺、鼻沖洗液中sIgA效價,對抗原進(jìn)行初步篩選。結(jié)果表明,與甲型

9、H1N1流感滅活全病毒相比,甲型H1N1流感裂解病毒作為噴鼻疫苗的抗原引起的免疫應(yīng)答水平較好。
　　(3)噴鼻流感疫苗黏膜佐劑的篩選：以IL-1β、IL-18、IL-33、可溶性ViE為待選疫苗佐劑,各2μg劑量,分別與殼聚糖季銨鹽水凝膠傳遞載體與甲型H1N1流感裂解病毒抗原(4μg)以1:1比例充分混合,制備噴鼻流感疫苗,分別免疫Balb/c小鼠,共免疫兩次,間隔時間為兩周。通過血清檢測其IgG及其亞型抗體效價、血抑效價,鼻、肺

10、、陰道沖洗液的分泌型抗體效價,篩選出最佳佐劑。實驗結(jié)果表明,IL-1β與其它幾種佐劑相比,疫苗佐劑效果較好,引起免疫應(yīng)答水平較高。
　　2、重組人IL-1β蛋白佐劑的制備及評價:從健康人外周血中分離白細(xì)胞,提取其總RNA,并通過PT-PCR方法獲得人源IL-1β基因序列的cDNA序列,構(gòu)建表達(dá)載體pET-24a(+)-IL-1β,在大腸桿菌DH5α中獲得了高效表達(dá)。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,并優(yōu)化其表達(dá)及純化條件,最后檢定其表達(dá)量、

11、純度、蛋白濃度和生物活性,以及其作為佐劑的有效性。結(jié)果表明,rIL-1β誘導(dǎo)表達(dá)的最佳培養(yǎng)溫度為33℃,培養(yǎng)時間為24h,初步純化的NaCl洗脫濃度為20mmol。表達(dá)重組的IL-1β蛋白濃度為2.25mg/mL,表達(dá)量大于30%,純度為94.5%,生物活性約為109個/mL。
　　rIL-1β蛋白佐劑效果評價：取本實驗制備的2μgIL-1β蛋白佐劑,并用進(jìn)口商品化的的IL-1β蛋白為對照,分別與殼聚糖季銨鹽水凝膠傳遞載體(1:1

12、)與甲型H1N1流感裂解病毒抗原(4μg)充分混合,制備噴鼻甲型H1N1流感裂解疫苗,分別在0d、14d免疫Balb/c小鼠,共免疫兩次,通過檢測其血清中IgG抗體效價、血抑效價,和鼻、肺沖洗液中sIgA效價,初步評價rIL-1β蛋白作為噴鼻疫苗佐劑的有效性。結(jié)果證明,所制備的重組IL-1β蛋白產(chǎn)物可以有效增強(qiáng)噴鼻疫苗的免疫效價,具有良好的黏膜佐劑效應(yīng)。
　　3、噴鼻流感三價裂解疫苗的制備及初步評價:以第一部分、第二部分研究結(jié)果為

13、基礎(chǔ),選用殼聚糖季銨鹽水凝膠作為疫苗載體,rIL-1β作為佐劑,制備季節(jié)性噴鼻流感三價裂解疫苗,并對其噴鼻免疫的效果進(jìn)行初步評價。
　　以甲型H1N1流感裂解抗原、B型裂解抗原和H3N2裂解抗原分別制備單價疫苗和三價疫苗,使抗原-佐劑的總體積與殼聚糖季銨鹽水凝膠的體積比為1:1,不足體積則用PBS溶液補(bǔ)全。以PBS組作為空白組,肌肉注射組為對照組,將以上噴鼻免疫Balb/c小鼠,分別在0d、14d免疫兩次。通過ELISA法對免疫前

14、后的小鼠血清中和抗體、IgG抗體及其抗體亞型和鼻沖洗液、肺沖洗液中的sIgA抗體效價進(jìn)行對比檢測,比較三價疫苗與單價疫苗的免疫效價和交叉免疫效果。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),噴鼻流感三價疫苗組中動物的血清中IgG抗體各亞型和HI效價顯著高于單價疫苗組,且低于肌注對照組;sIgA分泌型抗體效價和IFN-γ、IL-4分泌檢測結(jié)果均高于三種單價疫苗組和肌注對照組,說明噴鼻流感三價疫苗雖然在引起體液免疫方面不如肌肉注射疫苗,但是能有效且顯著地引起黏膜免疫和細(xì)

15、胞免疫應(yīng)答,好于現(xiàn)有的注射流感裂解疫苗。
　　結(jié)論：本研究中,從傳遞系統(tǒng)、黏膜佐劑、抗原類型和免疫應(yīng)答效果四個方面,對噴鼻流感三價疫苗進(jìn)行了組合物的篩選和初步評價。研究發(fā)現(xiàn),①在噴鼻流感三價疫苗的小鼠模型中,殼聚糖季銨鹽水凝膠作為噴鼻疫苗傳遞系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)效果好于殼聚糖、殼聚糖季銨鹽和殼聚糖水凝膠;②IL-1β作為黏膜佐劑對噴鼻疫苗的免疫增強(qiáng)效果好于IL-18、IL-33和水溶性ViE;③流感裂解病毒作為疫苗抗原的免疫效果明顯好于

16、滅活全病毒抗原。以上述篩選結(jié)果組成噴鼻甲型H1N1流感裂解疫苗,用4μg抗原經(jīng)0、14d兩次免疫后能夠誘導(dǎo)較理想的粘膜免疫和系統(tǒng)免疫應(yīng)答效果。此外,成功制備純度較高、具有生物活性且能增強(qiáng)噴鼻疫苗免疫效果的人源rIL-1β蛋白佐劑,并通過實驗證明其有較好的佐劑效果。以IL-1β為佐劑的噴鼻流感三價裂解疫苗,不僅能夠較好的誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答,而且能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答,從而為噴鼻流感三價裂解疫苗研究奠定了良好的基礎(chǔ),同時也為其它噴