噴鼻重組RSV疫苗株制備及免疫效果初步評價.pdf

1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是引起嬰幼兒和老年人下呼吸道疾病的重要病原體之一，其易感人群主要集中在嬰幼兒，65歲以上老年人以及免疫缺陷的成年人。據(jù)統(tǒng)計，全球每年由RSV引起的下呼吸道感染病例超過三千萬，其中10％的患者需要住院治療，2歲以內(nèi)的嬰幼兒RSV感染率超過90％。同時，RSV也是造成老年人和免疫缺陷成年人住院和肺炎死亡的首要病原之一。特別需要指出的是，RSV患者由于免疫力低下，

2、因此易發(fā)生臨床混合感染。其中，與流感病毒的混合感染超過50％。由于其病情高發(fā)，致病范圍廣，目前已引起全世界范圍的高度重視，成為全球性的公共衛(wèi)生問題。
　　疫苗是傳染病防控的重要手段，而RSV的疫苗研制一直也是大家所關(guān)注的熱點問題，WHO也將RSV疫苗列入全球最優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。經(jīng)過半個多世紀的研究，目前RSV疫苗研究已取得了階段性的進展。上世紀60年代最早出現(xiàn)的福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)由于在接種人群引起嚴重的免疫增強，最

3、終以失敗告終;根據(jù)表面糖蛋白制備的亞單位疫苗由于保護不全面，而難以成為臨床可用的疫苗株;隨后發(fā)展起來的減毒活疫苗及載體活疫苗雖然進入了臨床實驗階段，但由于其安全性存在隱患最終未能通過認證;近年獲批進入臨床實驗的RSV病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)疫苗多采用注射途徑免疫人體，激發(fā)機體產(chǎn)生細胞免疫有限，保護效果仍有不足。雖有多種類型的疫苗正在研制中，但目前仍沒有通過認證的RSV疫苗，因此發(fā)展安全有效RSV疫

4、苗迫在眉睫。
　　同時，傳統(tǒng)的疫苗接種途徑主要通過注射方式，其激發(fā)的細胞免疫應答十分有限，并且不能產(chǎn)生黏膜免疫反應。因此，在免疫接種途徑上尋求創(chuàng)新也成為RSV疫苗發(fā)展的重要突破口之一。
　　本項研究立足于RSV新型疫苗的構(gòu)建，致力于解決RSV疫苗免疫后Th1/Th2不平衡、細胞免疫受限、無黏膜免疫應答等瓶頸問題。主要包括如下兩方面研究工作:一是針對目前現(xiàn)有的VLP疫苗不能產(chǎn)生黏膜免疫應答的現(xiàn)狀，開展噴鼻免疫劑型研制，為解決如

5、何激發(fā)機體產(chǎn)生長效的細胞及黏膜免疫應答提供思路;二是針對目前臨床上RSV與流感混合感染頻發(fā)的現(xiàn)狀，開展噴鼻RSV與流感嵌合疫苗劑型，為“一苗兩用”提供方向。具體如下:
　　重組RSV-VLPs疫苗株制備及免疫效果評價
　　VLP是一種能夠模擬病毒形態(tài)但不具有復制能力的疫苗形式，由于其能夠高度富集病毒抗原，最大程度上模擬病毒天然結(jié)構(gòu)，能夠被宿主的免疫系統(tǒng)所識別，目前已成為病毒疫苗研究的發(fā)展方向。但由于RSV自身極難形成VLP結(jié)

6、構(gòu)，我們將流感的基質(zhì)蛋白M1與RSV的融合蛋白(fusion protein，F(xiàn))和粘附糖蛋白(attachment glycoprotein，G)進行結(jié)合，形成以流感M1蛋白為骨架，嵌合有RSV F/G蛋白的重組呼吸道合胞病毒樣顆粒(RSV-VLPs)，為RSV疫苗的發(fā)展提供了保證。
　　目的:采用Bac-to-Bac昆蟲表達系統(tǒng)表達以流感M1蛋白為骨架，嵌合有RSV F、G蛋白的RSV-VLPs候選疫苗株。經(jīng)滴鼻免疫6-8周齡

7、雌性BALB/c小鼠，評價其免疫原性及免疫保護效果，為新型RSV候選疫苗株提供思路。
　　方法:采用Vector NTI AdvanceⅡ系統(tǒng)進行序列優(yōu)化并合成。采用基因重組技術(shù)，成功構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pFastBac Dual-M1-F/pFastBac Dual-M1-G。以重組完全的Bacmid-M1-F/Bacmid-M1-G，轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細胞，獲取重組桿狀病毒，并進行重組RSV-VLPs的表達。以超濾濃縮，蔗糖密度梯度離心

8、法純化重組RSV-VLPs疫苗抗原。滴鼻免疫小鼠后，ELISA法檢測血清中IgG、IgG1、IgG2a以及鼻肺灌洗液中sIgA抗體效價，ELISPOT法檢測小鼠脾細胞懸液中IFN-γ及IL-4等細胞因子分泌水平，評價候選疫苗的免疫原性。二免二周后，以RSVA2株進行攻毒，通過檢測小鼠體重變化，肺病毒載量及肺病理切片評價候選疫苗的免疫保護性。
　　結(jié)果:Western blot鑒定重組RSV-VLPs疫苗抗原中目的蛋白均有表達，電鏡

9、下觀察重組RSV-VLPs疫苗抗原顆粒完整，大小均一?？烧J為成功制備重組RSV-VLPs疫苗抗原，分別命名為重組RSV-F VLPs疫苗株、重組RSV-GVLPs疫苗株。動物實驗結(jié)果證實重組RSV-VLPs疫苗免疫小鼠后能夠產(chǎn)生高滴度的RSV特異性抗體，且IFN-γ及IL-4等細胞因子水平較PBS對照組有明顯升高(p＜0.01)。攻毒實驗結(jié)果顯示候選疫苗RSV-VLPs能夠降低小鼠鼻肺病毒載量，減輕肺部病變。
　　結(jié)論:利用Bac

10、-to-Bac昆蟲表達系統(tǒng)制備的重組RSV-VLPs疫苗株具有良好的免疫原性，能夠激發(fā)機體產(chǎn)生以Th1型細胞為主的免疫應答，且可以有效誘導機體產(chǎn)生黏膜免疫反應。同時在RSV A2毒株攻擊后，RSV-VLPs候選疫苗也顯示出良好的免疫保護效果，為深入研究提供了實驗依據(jù)。
　　重組FLU/RSV/NA-F疫苗株制備及免疫效果評價
　　隨著反向遺傳學技術(shù)的飛速發(fā)展，以及流感病毒載體的自身優(yōu)勢，以流感病毒作為載體的疫苗傳遞系統(tǒng)已引起

11、廣泛關(guān)注。其優(yōu)勢主要表現(xiàn)在能夠產(chǎn)生雙重免疫保護效果，安全性高，易于大規(guī)模生產(chǎn)且具有十分廣闊的前景。目前已成功應用于Adv、HIV、TB等疫苗的研究。本研究主要采用反向遺傳學技術(shù)，重配以流感病毒為載體的rFLU/RSV/NA-F減毒活疫苗株，為發(fā)展RSV新型疫苗提供新思路。
　　目的:以冷適應流感減毒活疫苗株為載體，重配嵌合有RSV F蛋白中和抗體表位Ⅱ的FLU-RSV減毒活疫苗株。滴鼻免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠，評價其免疫

12、原性及免疫保護效果，為RSV疫苗研制提供新方向。
　　方法:采用反向遺傳學技術(shù)，對冷適應流感減毒活疫苗株NA基因進行改造，將RSVF蛋白抗原表位Ⅱ插入NA序列中，形成重組NA-F片段，同冷適應流感減毒活疫苗株其余七片段PB1、PB2、PA、HA、NA、NP和M進行重配，對重組FLU-RSV疫苗株進行拯救。通過血凝實驗、Western blot、透射電鏡等方法對其進行全面鑒定。同時測定其在體內(nèi)、體外的生長復制情況。對重組FLU-RS

13、V疫苗進行濃縮純化，滴鼻免疫小鼠后，ELISA法檢測血清中IgG、IgG1、IgG2a以及鼻肺灌洗液中sIgA抗體效價，ELISPOT法檢測小鼠脾細胞懸液中IFN-γ及IL-4等細胞因子分泌水平，評價重組FLU-RSV疫苗株的免疫原性。二免二周后，以RSV A2株進行攻毒，通過檢測小鼠體重變化，肺病毒載量及肺病理切片評價重組FLU-RSV疫苗株的免疫保護性。
　　結(jié)果:成功制備重組FLU-RSV疫苗株，并證實其在雞胚中可穩(wěn)定傳代，

14、且RSV F蛋白能夠穩(wěn)定表達，電鏡下觀察重組病毒形態(tài)完整，大小分布符合流感病毒粒子特征，證實重組FLU-RSV疫苗株拯救成功，命名為rFLU/RSV/NA-F。體內(nèi)體外復制情況測定結(jié)果顯示rFLU/RSV/NA-F疫苗株與H1N1冷適應減毒疫苗株復制情況基本一致，最適生長溫度均為33℃。動物實驗證實rFLU/RSV/NA-F疫苗株能夠誘導小鼠體內(nèi)產(chǎn)生RSV特異性的Th1型細胞免疫應答，同時有效激發(fā)機體產(chǎn)生黏膜免疫反應，證實rFLU/RS

15、V/NA-F疫苗株具有良好的免疫原性。攻毒實驗顯示rFLU/RSV/NA-F疫苗株可以降低免疫組肺組織病毒載量，改善肺水腫、出血等炎癥表現(xiàn)，可以對免疫小鼠產(chǎn)生一定的保護效果。
　　結(jié)論:采用反向遺傳學對rFLU/RSV/NA-F疫苗株進行拯救，并對疫苗株進行擴增純化后，滴鼻免疫小鼠，證實rFLU/RSV/NA-F疫苗株具有良好的免疫原性，在誘導機體產(chǎn)生免疫應答的同時有效避免了Th1/Th2不平衡問題。攻毒實驗證實rFLU/RSV/