表達結核桿菌抗原85A與GM-CSF黑色素瘤細胞誘發(fā)抗鼠瘤效應研究.pdf

1、惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)簡稱惡黑,是目前發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一,年增長率約3％-5％。研究證明,MM與免疫的關系十分密切,相繼發(fā)現(xiàn)的大量黑素瘤相關抗原提示腫瘤具有一定的免疫原性。因而免疫治療已成為繼手術、化學治療后的又一重要治療手段。黑色素瘤疫苗是利用黑色素腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體產生的特異性細胞和體液免疫反應,達到輔助殺傷腫瘤細胞目的,為主動特異性免疫治療方法之一。 卡介苗(BCG

2、)是最早用于腫瘤輔助治療的一種生物制劑,近年來研究者發(fā)現(xiàn)其對白血病、結腸癌、肝癌、肺癌和黑色素瘤都有輔助治療作用。人們在不斷地探索其治療腫瘤免疫機制的同時,從BCG里提取有效成分,并利用重組BCG等方法來提高治療腫瘤的效果且降低其副作用。為了探討具有免疫調節(jié)作用的結核桿菌濾過蛋白Ag85A能否作為佐劑誘導有效的抗黑色素瘤免疫效應,我們實驗室在研究中成功構建了結核桿菌Ag85A單表達、與細胞因子GM-CSF共表達重組質粒,探討了結核桿菌A

3、g85A、及結核桿菌Ag85A與GM-CSF誘導小鼠產生有效抗腫瘤的免疫效應。在此基礎上,本研究通過脂質體轉染Ag85A與GM-CSF基因到黑色素瘤細胞(B16-F10,以下簡稱B16),觀察結核桿菌Ag85A在作為異種抗原同時,可否又作為免疫佐劑,增強小鼠抗腫瘤免疫效應。本研究在動物實驗中證實,經過Ag85A和GM-CSF修飾的腫瘤細胞在小鼠體內能夠明顯降低其致瘤性；有效促進IFN-γ的分泌；增強NK、CTL細胞殺傷活性。具體體現(xiàn)在以

4、下兩個部分： 一、基于結核桿菌Ag85A表達載體的設計、構建與鑒定 目的：利用雙啟動子真核表達質粒pRSC,分別構建結核桿菌Agg5A表達重組質粒pRSC-Ag85A以及結核桿菌Ag85A與細胞因子GM-CSF共表達重組質粒pRSC-Ag85A/GMCSF。方法：用PCR方法從pIRES-Ag85A重組質粒中擴增出Ag85A基因,分別將其連接到重組質粒pRSC-GMCSF以及空質粒pRSC上,得到表達重組質粒pRSC-A

5、g85A/GMCSF、pRSC-Ag85A。結果：經酶切、基因測序、RT-PCR證實,重組質粒構建正確并能在黑色素瘤細胞成功表達目的基因。結論：基于Ag85A與GM-CSF的表達重組質粒構建成功,為研究不同基因轉染(pRSC-GMCSF、pRSC-Ag85A、pRSC-Ag85A/GMCSF)的腫瘤細胞誘導抗腫瘤免疫效應奠定了基礎。 二、基于表達結核桿菌Ag85A黑色素瘤細胞誘發(fā)抗腫瘤免疫效應與機制的研究 目的：研究共表

6、達結核桿菌Ag85A與GM-CSF的B16誘發(fā)的抗腫瘤免疫效應及評價Ag85A在抗腫瘤免疫效應中能否發(fā)揮抗原及佐劑作用。方法：將不同基因修飾的腫瘤細胞注射小鼠,經測量腫瘤大小觀察其致瘤性的強弱,荷瘤鼠的生存期,檢測小鼠脾CTL與NK細胞殺傷活性以及血清細胞因子IFN-γ水平,并通過病理切片分析免疫鼠抗腫瘤細胞免疫效應。結果：注射共表達結核桿菌Ag85A與GM-CSF B16細胞組小鼠生存期明顯延長,IFN-γ的分泌顯著增高,荷瘤鼠CTL