MONCPT抗黑色素瘤轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、喜樹堿類(camptothecin，CPT)藥物是以拓?fù)洚悩?gòu)酶I為靶點(diǎn)的新型抗腫瘤藥物，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和明確的療效，已成為臨床上使用最多的六大類抗腫瘤藥物之一。MONCPT(10-methoxy-9-nitro-camptothecin)是一類全新結(jié)構(gòu)的喜樹堿衍生物。前期研究發(fā)現(xiàn)，MONCPT體內(nèi)外均表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤生長及抗新生血管生成的活性。而大量文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，喜樹堿類衍生物如伊立替康(irinotecan，CPT-11)和拓?fù)涮婵?

2、topotecan，TPT)能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，據(jù)此我們?cè)O(shè)想MONCPT可能也具有一定的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。本文對(duì)MONCPT的體內(nèi)外抗黑色素腫瘤轉(zhuǎn)移的活性進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，并對(duì)其抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的機(jī)制開展了深入的研究。
　　 目的：研究MONCPT的體內(nèi)外抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，并探索其抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的機(jī)制。
　　 方法：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒至B16F10黑色素瘤細(xì)胞，流式檢測其轉(zhuǎn)染率；采用細(xì)胞板計(jì)數(shù)法及流式細(xì)胞周期檢測法檢

3、測GFP對(duì)細(xì)胞生長的影響；體外實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)(痕跡修復(fù)實(shí)驗(yàn))及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell法)分別評(píng)價(jià)MONCPT對(duì)細(xì)胞粘附、遷移及侵襲能力的影響，同時(shí)采用MTT法檢測MONCPT對(duì)細(xì)胞生長的影響；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用GFP-B16F10細(xì)胞C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型，檢測MONCPT的體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性；同時(shí)通過荷GFP-B16F10移植瘤的C57BL/6小鼠模型評(píng)價(jià)MONCPT的體內(nèi)抗腫瘤生長活性；我們用RT-P

4、CR法及Western blot法研究MONCPT在體內(nèi)外抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及蛋白表達(dá)，以及其對(duì)轉(zhuǎn)移信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.流式測定第四代GFP-B16F10細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率為90.32％，GFP-B16F10細(xì)胞與B16F10細(xì)胞的增殖時(shí)間及細(xì)胞周期基本相似。
　　 2.MONCPT體外對(duì)GFP-B16F10細(xì)胞的遷移和侵襲有明顯的抑制作用，且呈一定的量效關(guān)系。用不同

5、濃度的MONCPT(0.5、1.0和2.0μM)處理GFP-B16F10細(xì)胞12小時(shí)后，細(xì)胞侵襲活性的抑制率分別為24.2％、83.8％及91.4％，相比于對(duì)照組，均有顯著性差異。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在此濃度下MONCPT對(duì)腫瘤細(xì)胞生長活性的抑制率小于20％。
　　 3.GFP-B16F10細(xì)胞實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MONCPT(2.0、5.0和12.5 mg/kg/2 days)給藥14天后，肺轉(zhuǎn)移的抑制率分別為12.

6、8％、53.1％和76.3％，呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，且各給藥組與對(duì)照組比均具有顯著性差異。
　　 4.GFP-B16F10移植瘤模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MONCPT(2.0、5.0、12.5和31.3mg/kg/2 days)給藥14天后，腫瘤成長的抑制率分別為7.3％、6.4％、34.2％和57.7％，其中兩個(gè)高的劑量組相比于對(duì)照組出現(xiàn)顯著性差異。
　　 5.明膠酶譜法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MONCPT(0.5、1.0和2.0μM

7、)對(duì)黑色素瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白酶MMP-9的酶活性有顯著的抑制作用。
　　 6.RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，MONCPT對(duì)MMP-9的基因無顯著影響，而對(duì)其蛋白生成有顯著抑制作用。
　　 7.Western blot結(jié)果顯示，MONCPT對(duì)MMP-9的上游調(diào)節(jié)蛋白HIF-lα有顯著抑制作用。MONCPT對(duì)HIF-lα的活性修飾通路蛋白ERK的磷酸化有明顯抑制作用，MONCPT對(duì)AKT通路無明顯影響。