主要糧食作物深加工制品轉基因檢測技術研究.pdf

1、隨著各國有關GMO標簽法的建立和不斷完善，對食品中的GMO含量的下限已有所規(guī)定且不斷下降。但目前為止，國際上尚未建立對糧食作物深加工制品轉基因成分準確的定性和定量檢測技術。本實驗對主要糧食作物深加工制品的轉基因成分的檢測技術進行了深入研究，旨在于建立一套深加工轉基因制品的DNA提取、定性和定量檢測技術體系，為最終建立快速、高效和準確的GMO標準檢測方法提供依據。 ⑴在DNA提取方法研究的方面，篩選了多種DNA提取技術和方法，結果

2、將Wizard()試劑盒確定為深加工制品的最佳提取方法。與其它DNA提取方法相比較，該試劑盒提簡單、快速，DNA富集效果最佳，所提取的DNA作為模板進行隨后的定性和定量檢測，得到最佳結果。 ⑵在定性檢測技術方面，建立了多重巢式PCR轉基因檢測體系。針對已商品化的大豆、玉米和水稻主要含有CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因及共同的內標準基因RBCL基因的特點設計了10對引物，其中包括5對外引物和5對

3、內引物，對大豆、玉米和水稻經深加工的11個未知樣品進行了多重巢式PCR定性檢測。結果顯示，在l1份未知樣品中，卵磷脂、大豆蛋白質粉、巧克力飲品、嬰兒米粉含有轉CP4-EPSPS基因成分；玉米淀粉和玉米泥含有轉CrylA(B)基因和PAT基因成分；玉米蛋白粉含有轉CrylA(B)基因和BAR基因成分；營養(yǎng)麥片含有轉CrylA(B)基因成分：大豆精煉油、大豆色拉油和玉米油在定性檢測中未檢測出任何條帶，結果與巢式PCR結果一致。多重巢式PCR

4、適用于轉基因深加工制品的定性檢測，靈敏度達到0.005％，優(yōu)于已有的PCR檢測方法，該定性檢測方法具有特異、穩(wěn)定、準確、可以篩選多種轉基因成分的特點，為國際上轉CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因深加工制品轉基因檢測提供了有效的檢測技術。 ⑶建立了基于熔解曲線的多重RealtimePCR轉基因定性檢測體系。針對CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因設計特異性強且每個基

5、因擴增產物的解鏈溫度各不相同的引物，進行多重RealtimePCR反應。最終建立了對于CrylA(B)基因、CP4基因與PAT基因、BAR基因的兩個雙重PCR反應體系，檢測靈敏度都可達0.1％：對于CP4基因、PAT基因和BAR基因的的三重PCR反應，檢測靈敏度為0.5％：對于CrylA(B)基因、CP4基因、PAT基因和BAR基因的的四重PCR反應，檢測靈敏度為1％，以上多重RealtimePCR轉基因檢測體系的檢測限度都低于已建立的

6、GMO規(guī)范閾值。因此，這些最新建立的基于熔解曲線的Real-timePCR體系足以滿足常規(guī)GMO定性檢測。 ⑷在定量檢測技術方面，建立了TaqMan和SYBRGreenI兩種方法的轉基因定量檢測體系，并比較二者檢測結果。實驗證明，TaqMan探針和SYBRGreenI染料法在標準品定量分析試驗中標準差均小于0.2，靈敏度均達到0.01％，兩種方法的檢測結果沒有差異。同時SYBRGreenI定量檢測方法具有簡便快速、經濟實用、成本

7、低、結果可信的特點，完全適用于深加工制品的轉基因成分定量檢測。 ⑸建立了基于多重PCR反應的基因芯片轉基因檢測體系，檢測靈敏度可達0.25％。構建了可以檢測轉CP4-EPSPS基因、CrylA(B)基因、BAR基因和PAT基因的定性標準分子質粒。以解決實驗室普遍缺乏陽性標準物質的問題。 ⑹建立了一整套簡便、精確、快捷、成熟、可信度高的轉基因糧食作物深加工制品檢測技術體系，將為我國糧食作物轉基因產品定性、定量檢測標準化提供