兔肺缺血再灌注損傷致ALI免疫發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究表明，再灌注可以觸發(fā)一系列損傷反應(yīng)，引起相應(yīng)臟器致命性損傷。人們發(fā)現(xiàn)肺移植、體外循環(huán)手術(shù)、肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝除術(shù)、肺栓塞溶栓治療等多種臨床情況下發(fā)生肺缺血后再灌注，肺損傷不但沒(méi)有減輕反而加重，臨床上將這種現(xiàn)象稱為肺缺血再灌注損傷(LungIschemia-Reperfusionlung Injury，LIRI)。再灌注肺損傷的確切發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚，可能與炎性介質(zhì)、氧自由基、肺泡上皮和肺血管內(nèi)皮損傷等多種因素有關(guān)。由于大量炎性介質(zhì)和

2、細(xì)胞因子的釋放在再灌注早期可能導(dǎo)致肺微血管通透性增加。目前尚存在一些有待進(jìn)一步研究和解決的問(wèn)題，如能更深入地探討其發(fā)生機(jī)制、尋找更加有效的防治方法，對(duì)降低病死率，提高治愈率具有十分積極的意義。近年來(lái)，不斷探索尋找干預(yù)措施和藥物以減輕再灌注損傷，研究發(fā)現(xiàn)缺血后處理(ischemic postconditioning)是其中最有力的保護(hù)機(jī)制，已成為新的研究熱點(diǎn)。再灌注在臨床上是個(gè)可以預(yù)見(jiàn)并且可以控制的過(guò)程，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)“溫和再灌注”可

3、以減少梗塞面積、減輕水腫、避免無(wú)復(fù)流反應(yīng)，提出了缺血后適應(yīng)的概念。為此，我們以新西蘭大耳白兔，參考Eppinger的方法，通過(guò)夾閉阻斷一側(cè)肺門(肺動(dòng)脈、肺靜脈、支氣管動(dòng)脈和支氣管)，造成一側(cè)肺組織完全缺血和停止通氣，而后冉殲放肺門以形成肺組織的再灌注來(lái)建立在體兔肺缺血再灌注損傷模型，從肺實(shí)質(zhì)損傷、肺血管通透性、肺間質(zhì)改變、闡明肺缺血/再灌注肺損傷的發(fā)生機(jī)制，為尋找更加有效的防治方法，進(jìn)一步降低病死率，提高治愈率提供理論依據(jù)。同時(shí)藥物的應(yīng)

4、用是圍手術(shù)期的重要環(huán)節(jié)，已有研究發(fā)現(xiàn)某些藥物如利多卡因，地塞米松，山茛菪堿預(yù)處理對(duì)肺缺血再灌注損傷致急性肺損傷(ALI)具有保護(hù)作用，但仍有爭(zhēng)議，有關(guān)其后處理作用的研究較少，所以深入研究常用藥物對(duì)肺缺血再灌注損傷致ALI的影響具有重要的臨床意義。本研究采用兔肺缺血再灌注損傷模型，探討利多卡因，地寒米松，山莨菪堿預(yù)處理及后處理的肺保護(hù)作用，以期為臨床合理選擇藥物提供理論依據(jù)，為藥物臟器保護(hù)作用的深入研究開(kāi)辟思路。
　　 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主

5、要包括以下二部分：
　　 第一章：兔肺缺血再灌注損傷致ALI模型的建立及免疫發(fā)病機(jī)制研究
　　 目的：探討肺缺血/再灌注肺損傷致ALI的發(fā)生機(jī)制。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)以新西蘭大耳白兔，參考Eppinger的方法，通過(guò)夾閉阻斷一側(cè)肺門(肺動(dòng)脈、肺靜脈、支氣管動(dòng)脈和支氣管)，造成一側(cè)肺組織完全缺血和停止通氣，而后再開(kāi)放肺門以形成肺組織的再灌注來(lái)建立在體兔肺缺血冉灌注損傷模型。觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化、干/濕重比、肺組織和

6、BALF中TNF-a，IL-1，IL-6，IL-8的動(dòng)態(tài)變化；采用免疫組織化學(xué)和原位雜交方法研究了肺缺血再灌注過(guò)程中TNF-a，IL-1，IL-6，IL-8肺組織中的分布。
　　 結(jié)果：①BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)：與對(duì)照組相比，肺缺血60min、BALF中白細(xì)胞數(shù)量明顯增多；再灌注60min后進(jìn)一步增高，并于再灌注120min達(dá)到高峰(22.36±1.65，24.17±1.28，54.93±3.65，P<0.01)。再灌注60min

7、、冉灌注120min明顯高于缺血60min、120min水平，再灌注120min明顯高于再灌注60min水平(P均<0.01)。②肺缺血60min、120min BALF中PMN比例明顯增多，再灌注60min、再灌注120min持續(xù)增高，并于再灌注120min達(dá)到峰值(0.88±0.24，1.26±0.84，8.42±0.68，P<0.01)。③肺組織W/D：肺缺血60min、120min組明顯高于對(duì)照組和假手術(shù)組；再灌注60min組和

8、再灌注120min組(3.90±0.10，4.19±0.12，5.42±0.66，P<0.01)的W/D比前兩組增高更明顯。④TNF-a的變化：與對(duì)照組相比，肺組織勻漿中TNF-a在肺缺血60min時(shí)無(wú)明顯變化(7.90±1.89，P>0.05)，缺血120min時(shí)增高，再灌注60min后繼續(xù)增高，并于再灌注120min達(dá)到高峰(6.03±1.24，7.20±1.48，11.56±2.55，P<0.05)。再灌注120min組TNF-a

9、高于再灌注60min組(P<0.05)，并且明顯高于肺缺血60min組和120min組(P<0.05)。BALF中TNF-a的變化趨勢(shì)與肺組織勻漿中TNF-a的動(dòng)態(tài)改變相同。⑤IL-1，IL-6，IL-8的變化：與對(duì)照組相比，肺組織勻漿中IL-1，IL-6，IL-8在肺缺血60min時(shí)明顯升高(0.38±0.09，P<0.05)，缺血120min時(shí)升高，再灌注60min后繼續(xù)升高，并于再灌注120min最為明顯(0.29±0.09，0.

10、39±0.12，1.45±0.33，P<0.05)；并且再灌注120min時(shí)明顯高于缺血120min(P<0.05)。BALF中IL-1，IL-6，IL-8的變化趨勢(shì)亦與肺組織勻漿中IL-1，IL-6，IL-8的動(dòng)態(tài)改變相同。⑥免疫組織化學(xué)染色顯示：兔肺組織中TNF-a陽(yáng)性細(xì)胞主要在肺泡上皮細(xì)胞、部分支氣管上皮及炎細(xì)胞(單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)內(nèi)大量表達(dá)。與對(duì)照組相比，肺缺血60min、120min、再灌注60min、120min時(shí)，兔肺組織

11、TNF-a的表達(dá)均顯著增高(P<0.01)。并且再灌注60min、120min組明顯高于肺缺血60min、120min組，再灌注120min組高于再灌注60min組(P<0.01)。(7)相關(guān)性分析表明，TNF-a表達(dá)水平分別與W/D、肺組織中TNF-a的含量、BALF中的PMN比例及BALF中TNF-a，含量呈顯著負(fù)相關(guān)，r值分別為-0.95，-0.93，-0.97，-0.91，P均<0.01；TNF-a表達(dá)水平與肺組織及BALF中I

12、L-1，IL-6，IL-8的含量呈顯著正相關(guān)，r值分別為0.91和0.94，P均<0.05。(TNF-a陽(yáng)性表達(dá)越高而灰度值越低)(8)透射電鏡顯示超微結(jié)構(gòu)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、空泡化、部分胞漿溶解，核染色質(zhì)濃縮；Ⅱ型上皮細(xì)胞膜表面微絨毛數(shù)量顯著減少，嗜鋨性板層小體幾乎全部空化，線粒體部分或大部分嵴和膜融合消失。
　　 結(jié)論：①本試驗(yàn)以新西蘭大耳白兔，參考Eppinger的方法成功地建立肺缺血/再灌注的動(dòng)物模型，動(dòng)態(tài)觀察了肺缺血

13、、再灌注過(guò)程中動(dòng)脈氧分壓的變化特點(diǎn)。②從肺濕/干重比、組織形態(tài)學(xué)變化說(shuō)明肺缺血/再灌注兩個(gè)過(guò)程中均存在肺損傷，并且再灌注后損傷更為明顯。③PMN、氧自由基均參與了肺缺血/再灌注肺損傷的過(guò)程。④TNF-a，IL-1，IL-6，IL-8異常表達(dá)在肺缺血/冉灌注損傷中起一定作用，推測(cè)肺缺血/再灌注肺損傷的可能機(jī)制之一 PMN肺內(nèi)聚積、氧自由基爆發(fā)性呼吸介導(dǎo)TNF-a活化而調(diào)控 TNF-a，IL-1，IL-6，IL-8異常表達(dá)，導(dǎo)致肺損傷發(fā)生。

14、
　　 第二章：藥物干預(yù)兔肺缺血再灌注損傷致ALI的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：目前肺缺血再灌注損傷致ALI仍然是困擾心胸外科手術(shù)的難題，有關(guān)其防治措施的研究尚未獲得理想進(jìn)展。藥物的應(yīng)用是圍手術(shù)期的重要環(huán)節(jié)，已有研究發(fā)現(xiàn)某些藥物如利多卡因，地塞米松，山莨菪堿預(yù)處理對(duì)肺缺血再灌注損傷致ALI具有保護(hù)作用，但仍有爭(zhēng)議，有關(guān)其后處理作用的研究較少，所以深入研究常用藥物對(duì)肺缺血再灌注損傷致ALI的影響具有重要的臨床意義。本研究采用兔肺

15、缺血再灌注損傷模型，探討利多卡因，地塞米松，山莨菪堿預(yù)處理及后處理的肺保護(hù)作用，以期為臨床合理選擇藥物提供理論依據(jù)，為藥物臟器保護(hù)作用的深入研究開(kāi)辟思路。
　　 方法：成年新西蘭大白兔32只，隨機(jī)分為4組(n=32)。(1)缺血再灌注組(1/R組)：開(kāi)胸游離左肺門后，阻斷左肺門60min，而后松開(kāi)血管夾形成再灌注；(2)利多卡因預(yù)處理組(lido-Pre組)：前10min分別注射利多卡因1.2mg/kg，并分別以1.0mg/(k

16、g.h)維持30min后，阻斷左肺門60min，然后松開(kāi)血管夾形成再灌注；(3)山莨菪堿后處理組(ansi-PoS組)：開(kāi)胸游離左肺門后，阻斷左肺門60min，而后松開(kāi)血管夾形成再灌注；在恢復(fù)灌注同時(shí)，立即以山蓑若堿2mg/kg隨后以1mg/kg/h靜脈維持30min；(4)地塞米松預(yù)處理和后處理組(dex-Pre-PoS組)耳緣靜脈注入地塞米松o.o75mg/kg，30min后，阻斷左肺門60min，然后松開(kāi)血管央形成再灌注；在恢復(fù)灌

17、注同時(shí)，地塞米松o.o75mg/kg h靜脈維持30min。各組均于再灌注0min、30min、60min、120min、240min共5個(gè)時(shí)點(diǎn)分別處死動(dòng)物，留取動(dòng)脈血、肺組織和肺泡灌洗液標(biāo)本，測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓，肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比和蛋白含量，肺組織細(xì)胞因子 TNF-a、IL-1、IL-6，IL-8的濃度和肺泡灌洗液中細(xì)胞因子 TNF-a、IL-1、IL-6.IL-8的表達(dá)變化；并行光鏡、電鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改

18、變，免疫組化和原位雜交。
　　 結(jié)果：I/R組、lido-Pre組、ani-PoS組、dex-Pre-Pos組均隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的肺損傷變化，動(dòng)脈血氧分壓下降，TNF-a、IL-1、IL-6，IL-8，以及肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比和蛋白含量均明顯增高，TNF-a、IL-1、IL-6，IL-8的表達(dá)增加。與I/R組相比，利多卡因，地塞米松，山莨菪堿組各項(xiàng)觀察指標(biāo)在不同時(shí)間點(diǎn)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。利多卡因

19、，地塞米松，山莨菪堿組相比無(wú)顯著差異。病理切片顯示，1/R組肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)白細(xì)胞聚集成團(tuán)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間隔增寬，肺泡腔嚴(yán)重出血水腫，肺損傷較利多卡因，地塞米松，山莨菪堿組更加嚴(yán)重。透射電鏡也顯示1/R組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞板層小體窄泡化，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，其改變與利多卡因，地塞米松，山莨菪堿組存在差異。
　　 結(jié)論：利多卡因，地塞米松，山莨菪堿預(yù)處理和后處理均能減輕兔肺缺血再灌注損傷，具有明確的肺保護(hù)作用。其對(duì)再灌注后肺組織損傷的保

20、護(hù)作用可能是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，減少中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)、粘附與遷移，降低肺組織細(xì)胞因子 TNF-a、IL-1、IL-6，IL-8的表達(dá)與釋放，下調(diào)肺缺血再灌注損傷所致的表達(dá)，進(jìn)而減少多形核白細(xì)胞(PMN)在肺內(nèi)炎癥部位的聚集，降低肺組織的通透性，減少肺組織細(xì)胞一特別是肺泡11型上皮細(xì)胞的凋亡而實(shí)現(xiàn)的。利多卡因，地寒米松，山莨菪堿不同的處理時(shí)機(jī)一即預(yù)處理與后處理，其所產(chǎn)生的對(duì)肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用大致相似，推測(cè)可能是通過(guò)相似甚或相同的作用