改性PEG水凝膠—去細(xì)胞生物復(fù)合支架材料構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人工瓣膜置換術(shù)是目前世界上治療心臟瓣膜疾病的主要常規(guī)方法，人工瓣膜包括機(jī)械瓣和生物瓣兩大類。它的發(fā)明挽救了大部分瓣膜病患者生命，并提高了其生存質(zhì)量。但是都未達(dá)到理想程度，比如機(jī)械瓣需要終生抗凝，并且存在潛在性的出血、血栓形成和瓣體脫落引起栓塞的危險(xiǎn)；生物瓣耐久性不足，易鈣化、變性、衰敗、穿孔而失去功能。最重要的是人工瓣膜不具有再生長(zhǎng)的性能，特別是主要應(yīng)用于兒童的同種管道等等，因而在兒童病人的應(yīng)用中受到極大的限制[1,2],目前只有自體管

2、道如Ross手術(shù)中將自體肺動(dòng)脈移植到主動(dòng)脈位置，才能保持瓣膜和管道的繼續(xù)生長(zhǎng)[3],但是Ross手術(shù)要求技術(shù)難度高，風(fēng)險(xiǎn)大并且也只能適用于很少的一部分兒童病人，而且尚存在一些不確定因素—例如管道是否確切地能擔(dān)負(fù)起同步生長(zhǎng)而完全適應(yīng)其未來的生理需要呢[4]？所以尋找一種更加完善的瓣膜替代物，研發(fā)組織工程心臟瓣膜是其中一項(xiàng)具有廣闊前景的方法并且已經(jīng)取得了可喜進(jìn)展。
　　組織工程學(xué)就是應(yīng)用生物學(xué)和工程學(xué)的原理來發(fā)展一種可替代的組織，代表

3、了一種新興的科學(xué)概念，在體外制造出有活性細(xì)胞的間質(zhì)組織并具有抗血栓的表面，從而擁有自我修復(fù)和再塑形的能力，從而克服上述缺陷。截止目前，世界上已經(jīng)有組織工程皮膚和組織工程膀胱研制成功的報(bào)道。
　　現(xiàn)行組織工程的研究?jī)?nèi)容有三個(gè)關(guān)鍵部分，種子細(xì)胞選擇、支架材料選取和復(fù)合技術(shù)的改進(jìn)。早期，大多數(shù)組織工程瓣膜實(shí)驗(yàn)研究中多采用血管來源細(xì)胞，從而不可避免地具有一定缺陷，如細(xì)胞的收集必須要犧牲供體完整的血管結(jié)構(gòu)，并且因其細(xì)胞特性不同于瓣膜間質(zhì)細(xì)胞

4、，可能影響組織工程瓣膜的功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）可由受體骨髓采集，在體外分離和擴(kuò)增而獲得，并且可定向分化成各種細(xì)胞，包括骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞等等，亦有報(bào)道稱有向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化者。本課題選擇羊BMSCs作為種子細(xì)胞，因?yàn)槠湟子谕ㄟ^簡(jiǎn)單的骨髓穿刺而獲取，可以避免增加副損傷；BMSCs具有多向分化潛能、且能貼附在異體支架材料上生長(zhǎng)擴(kuò)增，在一定的微環(huán)境下有

5、向瓣膜間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的可能性。支架材料仍采用本中心研究的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜支架作為組織工程心臟瓣膜支架、并著重引進(jìn)PEG水凝膠技術(shù)，改進(jìn)細(xì)胞與材料支架的復(fù)合方法，進(jìn)行體外構(gòu)建組織工程心臟瓣膜；然后植入細(xì)胞供體羊的腹主動(dòng)脈內(nèi)進(jìn)行觀察，避免免疫排斥反應(yīng)的干擾，觀察體內(nèi)微環(huán)境對(duì)組織形成和細(xì)胞分化的影響。對(duì)組織工程心臟瓣膜的構(gòu)建進(jìn)行進(jìn)一步的研究與探索。
　　第一部分：分離、純化、擴(kuò)增并鑒定羊BMSCs細(xì)胞：經(jīng)Percoll密度梯度

6、離心和貼壁生長(zhǎng)的方法從采集的羊骨髓液中提取，通過倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，通過免疫組化及定向分化來進(jìn)行鑒定。結(jié)果：羊BMSCs免疫組化染色顯示：SH2,Vimentin均呈陽(yáng)性表達(dá)。CD34和VIII因子相關(guān)抗原的表達(dá)均為陰性。經(jīng)向脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后，油紅O染色顯現(xiàn)明顯的胞內(nèi)脂滴。結(jié)果表明經(jīng)此種方法分離純化而來的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能，而且細(xì)胞數(shù)量和活性滿意：10～15ml/羊的骨髓在20d左右經(jīng)4～6代培養(yǎng)后即可達(dá)到

7、(6.52±0.24)×107細(xì)胞數(shù)量級(jí)，能滿足組織工程種子細(xì)胞的需求。；
　　第二部分：去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣和改性PEG水凝膠的制備：采用滲透壓和Triton-X100結(jié)合的辦法制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜支架，并且進(jìn)行PEG水凝膠的改性，結(jié)合RGD、TGF-β1和VEGF，將BMSCs靜態(tài)種植于其上進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)種植細(xì)胞的效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果：應(yīng)用組織切片HE染色和掃描電鏡的方法證實(shí)BMSCs細(xì)胞的生物相容性較好，PEG水凝膠可以混勻

8、細(xì)胞，并將細(xì)胞緊密結(jié)合到去細(xì)胞生物支架上[PEG-TEHV組的細(xì)胞貼附率明顯高于Non-PEG組(2.592±0.005vs1.885±0.004)]；摸索出有效貼附到瓣膜上的細(xì)胞接種方法，可提高種子細(xì)胞的貼壁率和有效分布，為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)；
　　第三部分：體內(nèi)腹主動(dòng)脈移植實(shí)驗(yàn)：以去細(xì)胞豬主動(dòng)脈單瓣為支架、自體BMSCs為種子細(xì)胞包裹于改性PEG水凝膠完成細(xì)胞與支架的復(fù)合過程，當(dāng)單葉的組織工程瓣膜種植進(jìn)細(xì)胞供體羊的腹主動(dòng)脈

9、內(nèi)，我們進(jìn)行BMSCs種子細(xì)胞的體內(nèi)分化趨勢(shì)的觀察。組織工程心臟瓣膜(PEG-TEHV)作為A組；種植BMSCs細(xì)胞但無PEG包被處理作為B組；山羊自身主動(dòng)脈瓣膜設(shè)為C組為對(duì)照。分別于術(shù)后第16周后取材進(jìn)行形態(tài)、組織學(xué)、掃描和透射電鏡觀察以及生物力學(xué)檢測(cè)。分析BMSCs細(xì)胞在體內(nèi)的分化方向及比較三組之間的異同。結(jié)果：A組張力強(qiáng)度、內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率明顯優(yōu)于B組(0.85±0.02：0.14±0.01)；其中A組：B組附壁血栓形成率為0：10