基及腫瘤細胞靶向成像的研究于AIE現(xiàn)象發(fā)光機理的納米熒光探針的設計.pdf

1、第一部分具有聚集誘導發(fā)光特性殼聚糖納米顆粒的制備及其活細胞長程示蹤的研究
　　目的：制備具有聚集誘導發(fā)光(AIE)特性的殼聚糖(CS)納米顆粒,評價納米顆粒的理化特性、AIE特性和光穩(wěn)定性以及生物親和性,并探討其在活細胞長程示蹤標記中的應用價值。
　　方法：通過酰胺化反應將四苯基乙烯衍生物(TPEITC)化學連接到CS主鏈上生成TPE修飾的殼聚糖(TPE-CS),采用核磁(NMR)、紅外光譜(FTIR)分析檢測TPE的接枝率

2、。經(jīng)離子交聯(lián)法制備負載TPE分子的CS的納米顆粒(TPE-CSNPs),采用動態(tài)光散射(DLS)測定納米顆粒的水合粒徑、分散性,激光多普勒電泳法檢測納米顆粒的表面電位,透射電鏡(TEM)觀察納米顆粒的直徑和形態(tài)。采用熒光分光光度儀分析TPE-CSNPs的發(fā)光特性和pH值對其的影響。MTT法評價TPE-CSNPs的細胞毒性。通過不同濃度的TPE-CSNPs進行HeLa細胞染色以觀察該納米顆粒對細胞成像的濃度影響,并采用共聚焦激光掃描顯微鏡

3、(CLSM)連續(xù)激發(fā)染色細胞以計算該納米顆粒的光穩(wěn)定性。TPE-CSNPs入胞機制研究通過疊氮鈉(NaN3)阻斷三磷酸腺苷(ATP)的合成,抑制納米顆粒的進入胞內(nèi),采用CLSM或者流式細胞儀(FCM)檢測細胞內(nèi)熒光強度。TPE-CSNPs的出胞作用研究通過標記的HeLa細胞和未標記的3T3細胞共培養(yǎng),在CLSM下觀察納米顆粒的熒光分布情況。經(jīng)TPE-CSNPs標記的HeLa細胞持續(xù)培養(yǎng),每代觀察一次熒光強度變化,直至細胞內(nèi)熒光消失,以判

4、斷TPE-CSNPs對細胞的示蹤時間。
　　結果：通過TPEITC的異硫氰酸酯基和CS的胺基發(fā)生加成反應,成功合成了TPE-CS。1HNMR分析顯示CS中不存在的芳香環(huán)的化學位移峰出現(xiàn)在TPE-CS中,經(jīng)積分面積計算出TPE的接枝率為4.13％。FTIR檢測結果顯示TPEITC中的NCS在2045cm-1處的特征峰在產(chǎn)物TPE-CS中已消失。通過離子交聯(lián)法成功制備出TPE-CSNPs,DLS檢測顯示納米顆粒的水合粒徑為170nm,

5、分散性好,在TEM下觀察可見納米顆粒成球形、粒徑均一且單分散。PE-CSNPs的表面電位隨著溶液的pH值升高而逐漸降低,但在pH=7.0時仍為正電荷。TPE-CS在酸性溶液(pH2.5)中不發(fā)光,而TPE-CSNPs因TPE分子被固定在CS分子中而發(fā)出強熒光。當pH升高至7.0時,兩種的熒光強度均增強,但是TPE-CSNPs的仍強于TPE-CS。細胞的熒光強度隨著培養(yǎng)基中TPE-CSNPs的濃度增加而增強,且在連續(xù)激發(fā)30min后,細胞

6、的熒光強度僅下降不到25%。細胞經(jīng)NaN3預處理后,細胞內(nèi)ATP的合成被阻斷,限制了細胞的吞噬作用。與未經(jīng)處理的細胞相比,細胞的熒光強度較弱。標記的HeLa細胞和未標記的3T3細胞共培養(yǎng)24h后,CLSM下觀察納米顆粒大部分仍在HeLa細胞內(nèi),僅有極少量熒光出現(xiàn)在3T3細胞的區(qū)域。在細胞長程示蹤研究中,可見隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞內(nèi)的熒光強度呈下降的趨勢,但是染色后第7天仍可見熒光。
　　結論：TPE-CSNPs呈球形、直徑均一、

7、分散性好且表面帶正電荷,具有典型的AIE特性。TPE-CSNPs的細胞毒性低,并可通過細胞吞噬作用進入細胞內(nèi),且僅少量的納米顆粒經(jīng)出胞作用被排出到胞外,可長時間示蹤活細胞。因此,TPE-CSNPs有望成為一種長程示蹤活細胞的納米熒光探針,并可進一步應用于監(jiān)測藥物或者基因的負載和釋放。
　　第二部分生物素化的聚集誘導發(fā)光特性的硅膠納米顆粒的制備和生物親和性檢測及其腫瘤靶向成像的研究
　　目的：設計和制備對生物素受體高表達的腫瘤

8、細胞特異性結合的負載聚集誘導發(fā)光(AIE)特性的熒光硅膠納米顆粒(FSNPs)。評估該納米顆粒的理化特性和生物親和性,并檢測其對生物素受體表達上調(diào)的腫瘤細胞的靶向成像。
　　方法：通過溶膠-凝膠反應制備出負載噻咯衍生物1的熒光硅膠納米顆粒(FSNP-1),然后在其表面進行胺基化修飾(FSNP-1-NH2)。FSNP-1-NH2表面的胺基與生物素的羧基發(fā)生酰胺化反應,使生物素化學結合在納米顆粒表面(FSNP-1-biotin)。采用

9、紅外光譜儀分析納米顆粒表面的生物素基團,采用透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)觀察納米顆粒的直徑及形態(tài),采用X射線光電子能譜(XPS)和能量色譜X射線光譜(EDX)分析納米顆粒的化學成分,熱重分析(TGA)檢測納米顆粒的熱穩(wěn)定性并計算表面生物素分子的含量。通過細胞形態(tài)變化、細胞活性、細胞凋亡和細胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)等一系列檢測來評價FSNP-1-biotin的生物親和性。以生物素受體低表達的人正常肝細胞LO2對照,對生物素受體

10、高表達的人宮頸癌細胞HeLa和人肝癌細胞BEL-7402進行細胞成像,觀察進入細胞內(nèi)的納米顆粒的熒光強度,并行透射電鏡觀察納米顆粒進入細胞的過程。用FSNP-1-biotin標記HeLa細胞后,觀察其標記細胞的時間并用其示蹤腫瘤細胞遷移過程。
　　結果：通過溶膠-凝膠反應成功制備出FSNP-1,并通過化學反應修飾了生物素分子。紅外光譜顯示生物素分子的羰基(C=O)出現(xiàn)在FSNP-1-biotin上。TEM和SEM可見FSNP-1-

11、biotin呈球形、粒徑均一且分散性好。XPS和EDX分析顯示生物素分子中的硫元素出現(xiàn)在FSNP-1-biotin中。前體分子1在乙醇溶液中無熒光,而納米顆粒形成后其分子的旋轉受到硅膠基質的限制,從而發(fā)出強烈的熒光。經(jīng)FSNP-1-biotin處理后的細胞,細胞形態(tài)無顯著性改變,僅出現(xiàn)少量多核細胞,細胞質區(qū)域出現(xiàn)少量吞噬空泡。CCK-8和臺盼藍檢測顯示在濃度低于100μg/mL時,與對照組比較,毒性效應無統(tǒng)計學差異(P>0.05),而當

12、濃度達到100μg/mL時,對細胞具有明顯的毒性作用(P<0.05)。FSNP-1-biotin對細胞凋亡和細胞內(nèi)ROS水平在低濃度(40μg/mL)時無明顯影響(P>0.05),而在高濃度(80μg/mL)時在一定程度上促進細胞發(fā)生凋亡和提高細胞內(nèi)ROS水平(P<0.05)。FSNP-1-biotin靶向進入生物素受體高表達的腫瘤細胞中,并選擇性標記細胞質區(qū)域。這些納米顆粒通過受體介導的細胞吞噬作用進入細胞后,可長時間存留在細胞內(nèi),在