鐵蛋白納米籠為載體的多模式成像及靶向治療的研究.pdf

1、臨床上單獨(dú)使用化療的方法，常常會(huì)導(dǎo)致腫瘤的治療效果不佳，提出將診斷與治療相結(jié)合的方法，探索診療一體化的治療方案是提高腫瘤治療的有效手段之一。由于鐵蛋白具有高度的均勻性、可控的組裝性、還有易于修改和大量的制備，它受到了納米生物學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。本研究將鐵蛋白去除鐵核后，將藥物Doxorubicin包裹在AFn籠內(nèi)，表面修飾Fe3O4和Cdots后使其具有磁靶向能力和熒光標(biāo)記能力，通過(guò)周?chē)h(huán)境pH的變化控制藥物釋放。其主要內(nèi)容包

2、括：（1）構(gòu)建診療一體化的多功能鐵蛋白藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；（2）采用人源乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）為模型，評(píng)價(jià)其體外抗腫瘤活性；（3）采用鼠源黑色素瘤B16-F10細(xì)胞株，建立C57雌性小鼠荷瘤模型對(duì)其體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　為得到AFn/DOX復(fù)合物，首先將鐵蛋白去除鐵核后得到中空籠狀結(jié)構(gòu)的去鐵蛋白，然后利用鐵蛋白自組裝的性質(zhì)，使藥物小分子（DOX）包載在去鐵蛋白籠內(nèi)。為使納米載體具有熒光探針性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)腫瘤診斷功能，本研究通過(guò)酰胺

3、鍵將Cdots連接到AFn/DOX復(fù)合物表面；為實(shí)現(xiàn)磁靶向和核磁成像功能，本研究將AFn/DOX-Cdots中間產(chǎn)物連接到四氧化三鐵納米粒子的表面，構(gòu)建出了一種多功能的Fe3O4-AFn/DOX-Cdots納米轉(zhuǎn)運(yùn)藥物載體，該多功能納米轉(zhuǎn)運(yùn)藥物載體具有磁靶向能力和核磁成像能力，使腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物有更高的攝取量，提高了腫瘤治療指數(shù)；同時(shí)又可以實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤位置的動(dòng)態(tài)變化，實(shí)現(xiàn)腫瘤在熒光方向的診斷。
　　Fe3O4-AFn/

4、DOX-Cdots納米載藥體系的制備主要采用攪拌的方法，在EDC和NHS的催化作用下，羧基與氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，并優(yōu)化處方。將制備得到的Fe3O4-AFn/DOX-Cdots納米復(fù)合物分別用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、紅外分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)進(jìn)行了表征；采用Nano-zs90型激光納米粒度分布儀檢測(cè)，結(jié)果顯示，去鐵蛋白的平均粒徑約為12±2.0nm，PDI為0.2左右，Cdots水溶液粒度分布均勻，平均粒徑約為5±2.0nm，PDI為0.

5、2左右；采用熒光分光光度計(jì)對(duì)不同pH值的Cdots水溶液熒光強(qiáng)度進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，pH=4.0時(shí)Cdots水溶液具有最大的熒光強(qiáng)度；透射電鏡（TEM）結(jié)果顯示，F(xiàn)e3O4-AFn/DOX-Cdots為類(lèi)球形；采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)藥物的吸光度，測(cè)定載藥系統(tǒng)中 DOX的載藥量，結(jié)果表明，DOX在納米復(fù)合物中的載藥量達(dá)6.3％；在37℃條件下，采用透析袋法分別測(cè)定了Fe3O4-AFn/DOX-Cdots在pH=5.0和pH=7.4時(shí)

6、DOX的體外釋放，結(jié)果表明酸性條件更適合該體系釋放藥物，通過(guò)調(diào)節(jié)酸堿度能較好的控制藥物釋放；Fe3O4-AFn/DOX-Cdots具有強(qiáng)磁性，MRI實(shí)驗(yàn)表明Fe3O4-AFn/DOX-Cdots在磁共振T2場(chǎng)成像，具有明顯的濃度依賴性和黑化效應(yīng)。
　　本研究選擇人源的乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）作為其體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)的模型，采用MTT法考察了Fe3O4-AFn-Cdots空白載體的細(xì)胞毒性及對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，空白載體對(duì)細(xì)

7、胞幾乎沒(méi)有毒性作用，可以認(rèn)為載體是無(wú)毒的；同時(shí)又考察了 Fe3O4-AFn/DOX-Cdots的細(xì)胞毒性及其濃度、作用時(shí)間與磁場(chǎng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，在72h時(shí)，當(dāng) DOX濃度為50μg/ml的抑制率最大，顯著增強(qiáng)了細(xì)胞得抑制率，明顯增強(qiáng)細(xì)胞的毒性；與Fe3O4-AFn/DOX-Cdots不加磁組相比，F(xiàn)e3O4-AFn/DOX-Cdots/magnet組有更多的細(xì)胞攝入量，表明Fe3O4的磁靶向特性更有利于包裹的藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)

8、部；在MCF-7攝取實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)初步研究了其細(xì)胞毒作用機(jī)制，并采用空白載體考察Cdots連接到載體后的細(xì)胞成像情況，F(xiàn)e3O4-AFn-Cdots納米復(fù)合物進(jìn)入到MCF-7細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)24h后，明顯呈現(xiàn)出大量藍(lán)色點(diǎn)狀熒光。
　　采用鼠源黑色素瘤B16-F10細(xì)胞株，建立C57雌性小黑鼠荷瘤作為其體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)的模型。Fe3O4-AFn/DOX-Cdots的體內(nèi)抗腫瘤效果評(píng)價(jià)中，考察了 Fe3O4-AFn/DOX-

9、Cdots納米載藥體系對(duì)荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用，結(jié)果表明Fe3O4-AFn/DOX-Cdots在磁靶向的載藥系統(tǒng)作用下藥物更易于滯留在腫瘤部位，在腫瘤部位的酸性環(huán)境下，藥物更易從鐵蛋白籠內(nèi)釋放出來(lái)，實(shí)現(xiàn)殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。DOX在小鼠血漿的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4-AFn/DOX-Cdots明顯延長(zhǎng)了 DOX在血液中的循環(huán)停留時(shí)間。此外，MRI結(jié)果顯示注射Fe3O4-AFn/DOX-Cdots后，在外加磁場(chǎng)作用下，小鼠腫瘤部位

10、觀察到明顯的黑化現(xiàn)象，說(shuō)明Fe3O4-AFn/DOX-Cdots可作為體內(nèi)核磁成像T2場(chǎng)的造影劑。
　　體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明：Fe3O4-AFn/DOX-Cdots可以有效的靶向 MCF-7細(xì)胞，并高效的穿透細(xì)胞膜，攜帶更多的DOX進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，腫瘤酸性環(huán)境使鐵蛋白籠打開(kāi)，釋放出藥物，從而誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，最終抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。體內(nèi)的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明：Fe3O4-AFn/DOX-Cdots具有較低的系統(tǒng)毒性