神經(jīng)酰胺AD2646抑制人肺腺癌細胞A549生長的實驗研究.pdf

1、第一部分神經(jīng)酞胺AD2646對人肺腺癌細胞A549體外生長的抑制作用和機理探討 目的：探討神經(jīng)酰胺 AD2646 對人肺腺癌細胞 A549 體外生長的抑制作用和機理。 方法：神經(jīng)酰胺AD2646作用于人肺腺癌細胞A 549后，MTT法繪制細胞生長曲線，熒光分析檢測Caspase-3活性，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，調(diào)亡細胞DNA電泳進行凋亡分析。薄層層析色譜分析(TLC)檢測細胞葡糖苷鞘氨醇合成酶 (GC)鞘磷脂合成酶 (S

2、M)水平，高效液相色譜分析 (HPLC)檢測細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平。 結(jié)果：本研究通過 MTT 法繪制神經(jīng)酰胺 AD2646 作用于 A549 細胞后的生長曲線，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺．AD2646 處理組細胞的生長曲線較對照組出現(xiàn)了明顯的下移；劑量越大，細胞的生長曲線下移更為明顯；處理組細胞24h后即出現(xiàn)生長不良，72h后細胞稀疏，呈散在分布。 熒光分析發(fā)現(xiàn)AD2646對A549細胞Caspase-3活性有明顯影響。但CaspaSe

3、-3活性增加主要表現(xiàn)在藥物處理的早期，而且在觀察時段內(nèi)給藥量與最終細胞生長抑制的強度及Caspase-3活性水平并不一致。 FCM 細胞凋亡分析及 DNA 電泳細胞調(diào)亡分析均表明，神經(jīng)酰胺AD2646在體外抑制A549細胞生長過程中有凋亡現(xiàn)象發(fā)生，F(xiàn)CM分析還顯示，在一定的時間與劑量范圍內(nèi)，AD2646 誘導細胞凋亡，一定程度上還呈現(xiàn)劑量依從性。 TLC法發(fā)現(xiàn)外源性神經(jīng)酰胺AD2646在加量的早期即對A549細胞GC/SM活性有

4、抑制作用，其中對GC的抑制作用比對SM的抑制作用更強，在加入神經(jīng)酰胺AD2646作用后，20min即達到高峰，并在以后維持較高水平。高效液相色譜分析顯示細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平在加藥早期即明顯地迅速提高，30min～40min即達高峰，以后維持在一較高水平。 結(jié)論： ①神經(jīng)酰胺作為脂質(zhì)第二信使，參與調(diào)控細胞增殖、分化以及凋亡；其類似物AD2646可抑制肺腺癌細胞系A(chǔ)549的生長，抑制效應具有劑量與時間雙重依從性；同時能誘導A5

5、49細胞凋亡，凋亡效應在一定程度上呈現(xiàn)劑量依從性。 ② Caspase-3雖參與了AD2646誘導的A549細胞凋亡，但可能還有其他效應路徑參與了AD2646誘導的A549細胞凋亡。 ③外源性的神經(jīng)酰胺AD2646在作用于A549細胞后，加量的早期對A549細胞GC/SM活性即有抑制作用，其中對GC的抑制作用比對SM的抑制作用更強。 ④細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平在加藥早期即顯著地迅速提高，30min～40min即達高峰，

6、以后維持較高水平而無明顯進一步升高。 ⑤ A549細胞的GC/SM活性受抑情況，胞內(nèi)神經(jīng)酰胺濃度的變化，與Caspase-3活性的早期檢測結(jié)果并不平行，提示AD2646誘導A549細胞凋亡，除了Caspase蛋白酶家族，還應有其它的效應信號路徑參與。 第二部分神經(jīng)酰胺AD2646對人肺腺癌細胞A549移植瘤生長的抑制作用觀察 目的：評價神經(jīng)酰胺類似物AD2646對人肺腺癌A549裸鼠移植瘤生長的影響，為進一步應用

7、于肺癌臨床治療提供實驗依據(jù)。 方法：建立裸鼠皮下移植瘤模型，將其隨機分為三組，①神經(jīng)酰胺AD2646治療組：10mg/kg腹腔注射，接種后第一天開始，每間隔2天給藥1次，共給藥14次；②生理鹽水對照組：注射NS，注射容積量及方法同第一組；③10％CE對照組：注射容積量及方法同第一組。觀察移植瘤大小，末次給藥24h后，脫頸椎處死裸鼠，解剖摘除皮下移植瘤，進行觀察，并對裸鼠進一步行血液學、血清酶學、臟器病理學、腫瘤病理學觀察；流式細

8、胞儀術(shù)及TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡，RT-PCR及Western blot檢測移植瘤細胞中Caspase-3 mRNA及蛋白表達。 結(jié)果：2周后，AD2646組與CE組及NS組移植瘤大小比較無明顯差異；2周后～3周時，AD2646處理組瘤體顯著小于NS組(P<0.01)； 但CE組也小于NS組(P<0.01)。AD2646組瘤體重量與CE組及NS組比較，P<0.01，有極顯著統(tǒng)計學差異；CE組及NS組無并無統(tǒng)計學意義

9、。肉眼及光鏡下觀察，各組裸鼠的心、肝、肺、腎等臟器均未見明顯病理學改變。AD2646 處理組WBC計數(shù)與NS組、CE組比較有明顯差異(P<0.01)，低于正常；而各組的紅細胞、血小板計數(shù)均正常，各組間兩兩比較沒有統(tǒng)計學差異。觀察各組之間血清生化指標沒有統(tǒng)計學差異。NS及CE組鏡下主要表現(xiàn)為中分化腺癌的特點，瘤細胞呈浸潤生長，壞死較少。AD2646處理組瘤組織中細胞數(shù)減少，較多的壞死灶，細胞核溶解，碎裂少。AD2646處理組G1期細胞較對

10、照組為低，而G2+M期細胞比例則較高，兩者均有統(tǒng)計學意義P<0.05。流式細胞術(shù)分析，AD2646處理組細胞凋亡率為9.61％，是對照組的3-4倍。TUNEL檢測移植瘤細胞凋亡，計數(shù) 5 個高倍視野的陽性細胞，亦較對照組，明顯較高；AD2646 處理組 Caspase-3 mRNA 及蛋白表達也明顯高于NS與CE組。 結(jié)論：神經(jīng)酰胺類似物AD2646可抑制人肺腺癌A549裸鼠移植瘤生長，誘導移植瘤細胞凋亡，增加移植瘤中Caspa