GLS-IL-12重組沙門菌抗腫瘤的實驗研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩102頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、腫瘤是一類嚴重危害健康、影響生活質量的重大疾病。目前全球每年因癌癥死亡的人數(shù)約為760萬,70%以上發(fā)生在低收入和中等收入國家。在我國腫瘤死亡已位居各類死因第一位,每年死于腫瘤的人數(shù)約150萬?;蛑委熓墙陙?,隨著細胞生物學和分子生物學理論和技術的飛速發(fā)展繼手術治療、放射治療和化學治療后的一種新型治療手段。目前,腫瘤的基因治療已成為備受矚目的研究領域。 課題設計構建了能分泌表達促凋亡因子(GLS)和免疫調節(jié)因子(白細胞介素-1

2、2)的真核共表達質粒pBudCE4.1-S9K/mlL-12,并構建了能將該質粒遞送到腫瘤組織的重組沙門菌,在小鼠黑色素瘤模型上觀察了局部注射和口服給予重組沙門菌的抗瘤作用。 第一部分人GLS活性肽和小鼠IL-12基因真核共表達質粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12的構建及表達 目的:構建能分泌表達人GLS活性肽和小鼠IL-12的真核共表達質粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,并檢測其表達。 方法:

3、將 GLS 分泌肽的編碼序列加入到引物序列中,以含GLS基因(不含分泌肽)的質粒pZMO3為模板,采用PCR擴增出含分泌肽基因的人GLS活性肽基因。然后定向克隆入真核共表達質粒pBudCE4.1的多克隆位點,構建GLS活性肽的真核表達質粒pBudCE4.1-S9K,測序確認正確。將其轉染細胞后,以反轉錄PCR(RT-PCR)和免疫細胞化學法分別檢測mRNA水平和蛋白水平的表達。將質粒pZMO2中的小鼠白細胞介素12(murine ime

4、rleuldn 12,mlL-12)亞克隆到pBudCE4.1-S9K,構建真核共表達質粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12。轉染細胞后,以RT-PCR,DOT-ELISA和ELISA檢測試劑盒檢測GLS和mIL-12的表達與分泌。 結果:成功擴增出含分泌肽編碼序列的人GLS活性肽基因。構建的真核表達質粒pBudCE4.1-S9K經(jīng)PCR,雙酶切和雙向測序鑒定基因序列完全正確。pBudCE4.1-S9K轉染細胞,經(jīng)RT-P

5、CR擴增出特異性267bp左右的目的條帶;經(jīng)免疫細胞化學檢測到轉染細胞內明顯的棕黃色表達顆粒。真核共表達質粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12轉染細胞,經(jīng)RT-PCR擴增出特異性267bp和1632bp左右的GLS基因和mIL-12基因條帶;轉染細胞上清中用ELISA試劑盒檢測到mIL-12的分泌;轉染細胞上清用DOT-ELISA檢測出現(xiàn)明顯的斑點。 結論:成功構建能分泌表達人GLS活性肽和小鼠IL-12的真核共表達質粒p

6、BudCE4.1-S9K/mIL-12。 第二部分人GLS活性肽和小鼠IL-12基因真核共表達質粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12的體外抗瘤效應 目的:檢測人GLS活性肽和小鼠IL-12基因的真核共表達質粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12對腫瘤細胞的影響。 方法:將pBudCE4.1-S9K/mIL-12轉染小鼠黑色素瘤細胞B16,先以RT-PCR檢測腫瘤細胞內GLS的表達,然后采用MTT法檢測其

7、對腫瘤細胞的增殖抑制作用;用Hoechst 33258,細胞壞死/凋亡/正常細胞鑒別試劑盒(AO/EB)染色觀測腫瘤細胞的凋亡;用Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶雙染檢測細胞凋亡早期細胞膜的變化,流式細胞術檢測凋亡細胞的數(shù)量。 結果:用RT-PCR檢測到GLS在B16中表達的特異性條帶。MTT法檢測,GLS明顯抑制腫瘤細胞增殖,抑制率達到34.27%。細胞轉染48h,用Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶雙染,流式細胞儀

8、檢測,轉染pBudCE4.1-S9K/mIL-12質粒的腫瘤細胞處于凋亡期的比率為21.02%,比空質粒對照(凋亡率5.45%)增高了約15.57%。轉染pBudCE4.1-S9K/mIL-12的腫瘤細胞,72h后細胞出泡,細胞核濃縮,致密,碎塊狀,Hoechst 33258染色成亮藍色,平均凋亡指數(shù)達31.40±4.01%;而空質粒對照細胞核形態(tài)正常,染色淺淡,凋亡指數(shù)為5.70±1.64%。轉染后48小時和72小時,腫瘤細胞經(jīng)AO/

9、EB染色在熒光顯微鏡下區(qū)分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。正常細胞被染成綠色,細胞與胞核形態(tài)正常。壞死細胞由于失去了核膜的完整性,細胞核被溴化乙錠染成紅色。而凋亡細胞胞特有膜外翻、膜出泡、棒狀或芽狀突起等形態(tài),細胞被染成橙色,核形態(tài)不規(guī)則。細胞凋亡率為32.80±4.83%。 結論:pBudCE4.1-S9K/mIL-12轉染小鼠黑色素瘤細胞B16,能抑制腫瘤細胞的增殖,促進腫瘤細胞凋亡。 第三部分攜帶人GLS活性肽和小鼠

10、IL-12基因的重組沙門菌的構建 目的:構建攜帶人GLS活性肽與小鼠IL-12基因的重組沙門菌,并鑒定該重組菌向真核細胞遞呈質粒的能力。 方法:制備沙門菌感受態(tài),以電轉化的方式將pBudCE4.1-S9K/mIL-12質粒轉入細菌構建重組沙門菌,抽提質粒進行PCR鑒定重組菌;并在含Zeocin抗生素的低鹽LB平板上反復傳代培養(yǎng),鑒定沙門菌攜帶質粒的穩(wěn)定性。以相同方法構建含pBudCE4.1,pBudCE4.1-S9K,p

11、BudCE4.1/mIL-12質粒的重組沙門菌作為動物實驗對照菌。將質粒pEGFP-C1和pEGFP-C1/S9K轉入沙門菌,然后感染小鼠巨噬細胞,通過RT-PCR.和細胞熒光表達觀察反映重組菌向真核細胞遞呈質粒的能力。用pBudCE4.1-S9K重組沙門菌感染黑色素瘤細胞B16,48h后提取細胞總RNA,用RT-PCR法擴增GLS基因條帶,了解沙門菌感染黑色素瘤細胞的能力。 結論:成功構建含pBudCE4.1-S9K/mIL-

12、12的重組沙門菌及含pBudCE4.1,pBudCE4.1-S9K,pBudCE4.1-mIL-12質粒的重組沙門菌。攜帶質粒的重組沙門菌能穩(wěn)定傳代15代。重組沙門菌能向小鼠巨噬細胞遞呈攜帶基因。重組沙門菌對小鼠黑色素瘤細胞有一定的感染能力。 第四部分攜帶GLS與IL-12真核共表達質粒重組沙門菌局部注射抗腫瘤實驗 目的:建立小鼠黑色素瘤模型,觀察含pBudCE4.1-S9K/mIL-12的重組沙門菌局部瘤內注射的抗瘤效

13、果。 方法:C57BL/6J純系小鼠于前肢右側腋下皮下接種腫瘤細胞B16,每鼠10<'6>細胞(0.1ml細胞懸液),待腫瘤長到1cm大小時,取瘤組織病理切片HE染色確認腫瘤模型。以10<'4>/ml,10<'6>/ml,10<'8>/ml,10<'10>/ml瘤內注射0.1ml觀測腫瘤生長情況,確定治療劑量。以腫瘤接種后1,4,7,10天開始治療,確定治療起始時間。治療分6組,分別用PBS,沙門菌,含pBudCE4.1,pBu

14、dCE4.1-S9K,pBudCE4.1/mIL-12,pBudCE4.1-S9K/mIL-12質粒的重組沙門菌進行瘤內注射治療,從腫瘤接種后1天開始治療,每次0.1ml(10<'8>/ml),一周一次共4次。隔日觀察腫瘤生長情況,測量腫瘤大小和觀察帶瘤存活期。取小鼠血清用ELISA試劑盒檢測IFN-Y和IL-12的變化。取腫瘤組織行病理切片HE染色觀察腫瘤病理變化。 結論:攜帶pBudCE4.1-S9K/mIL-12質粒的重組

15、沙門菌瘤內注射對小鼠黑色素瘤有一定的治療作用。 第五部分口服給藥觀察GLS與IL-12真核共表達質粒重組沙門菌體內抗腫瘤效應 目的:探討口服給予含pBudCE4.1-S9K/mIL-12質粒的重組沙門菌對小鼠黑色素瘤的抗瘤效果。 方法:C57BL/6J純系小鼠于前肢右側腋下皮下接種腫瘤細胞B16,每鼠10<'6>細胞(0.1ml細胞懸液),建立小鼠黑色素瘤模型??诜EGFP-C1重組沙門菌,48小時后,解剖取出

16、瘤體組織,固定,切片,于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況了解沙門菌的腫瘤靶向性。治療分6組,分別用PBS,沙門菌,含pBudCE4.1,pBudCE4.1-S9K,pBudCE4.1/mIL-12,pBudCE4.1-S9K/mIL-12質粒的重組沙門菌進行灌胃治療,從接種腫瘤細胞即開始治療,每次0.1ml(10<'9>/ml),每周一次,共4次。隔日觀察腫瘤生長情況,測量腫瘤大小和帶瘤存活期。取小鼠血清用ELISA試劑盒檢測IFN-γ

17、和IL-12的變化。取腫瘤組織行病理切片HE染色觀察腫瘤病理變化。 結果:口服pEGFP-C1重組沙門菌48小時后,在腫瘤組織觀察到綠色熒光蛋白的表達。與PBS組和沙門菌組相比,用pBudCE4.1-S9K/mIL-12重組沙門菌進行治療,腫瘤生長受抑制,腫瘤體積較小(p<0.05);小鼠血清中的IL-12和IFN-γ升高(p<0.05);帶瘤存活期延長;病理檢測可見腫瘤組織有壞死和淋巴細胞的浸潤。 結論:攜帶pBudC

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論