VE-cadherin重組腺病毒偶聯(lián)氧化型甘露聚糖抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：以血管為靶向的抗血管治療已成為目前抗腫瘤治療的一種新策略。VE-cadherin(Vascularendothelial-cadherin，血管內(nèi)皮鈣粘附素)是內(nèi)皮細(xì)胞特異性粘附分子，對其正常生理具有重要作用，抑制VE-cadherin可作為抗腫瘤新生血管形成的治療手段。樹突狀細(xì)胞(DC)是機(jī)體強(qiáng)有力的抗原遞呈細(xì)胞(APC)，細(xì)胞表面高表達(dá)甘露糖受體(MR)，能介導(dǎo)高效的抗原識別與攝取作用。本研究擬通過制備重組鼠VE-cadher

2、in腺病毒，經(jīng)氧化型甘露聚糖修飾，觀察在小鼠腫瘤模型中抗腫瘤血管免疫效應(yīng)并進(jìn)行初步分析。 方法：從小鼠胚胎提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增小鼠VE-cadherin全長cDNA基因。經(jīng)T-A克隆并作酶切鑒定和測序確認(rèn)，進(jìn)一步酶切將目的基因連接到穿梭質(zhì)粒載體。酶切鑒定后與病毒骨架質(zhì)粒在電擊下共轉(zhuǎn)化，發(fā)生同源重組形成重組腺病毒質(zhì)粒。經(jīng)過鑒定，轉(zhuǎn)染包裝，篩選，擴(kuò)增，純化，制備高滴度重組病毒。在體外經(jīng)氧化型甘露聚糖修飾(簡稱AdVEC-m

3、)后腹腔注射免疫小鼠。觀察AdVEC-m對小鼠LLC，CT26腫瘤的保護(hù)或治療效應(yīng)以及抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)；對腫瘤組織切片內(nèi)微血管作CD31免疫組化染色；利用藻酸鹽包裹腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察對小鼠體內(nèi)腫瘤血管生成抑制情況；通過ELISA、Westernblot檢測抗體對抗原的識別能力；51Cr釋放法檢測脾T細(xì)胞及抗體對內(nèi)皮細(xì)胞的特異殺傷活性；同時(shí)T細(xì)胞亞群阻斷實(shí)驗(yàn)觀察不同T細(xì)胞亞群在抗腫瘤效應(yīng)中的作用。 結(jié)果：制備高滴度重組小鼠VE-cadhe

4、rin腺病毒，經(jīng)氧化型甘露聚糖反應(yīng)修飾，能有效誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)。表現(xiàn)為AdVEC-m治療組腫瘤生長緩慢，小鼠生存期延長，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于對照組，腫瘤組織內(nèi)微血管密度降低，體內(nèi)藻酸鹽微球表面及內(nèi)部血管生成減少。免疫學(xué)分析顯示AdVEC-m能激發(fā)小鼠特異的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，51Cr釋放實(shí)驗(yàn)顯示內(nèi)皮細(xì)胞特異性的CD8+細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)，以及CDC(補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)和ADCC(抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性)。CD4+及CD8+淋巴細(xì)胞亞型去除