Hyper-IL-6重組腺病毒的構(gòu)建及其促肝細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、第一部分Hyper-IL-6重組腺病毒的構(gòu)建及其在真核細(xì)胞中的表達(dá) 目的：構(gòu)建融合基因超級(jí)白介素6(Hyper-IL-6)，應(yīng)用腺病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)AdEasysystem構(gòu)建重組腺病毒Ad-HIL-6。用Ad-HIL-6感染人肝細(xì)胞L02，觀察細(xì)胞內(nèi)Hyper-IL-6mRNA和蛋白的表達(dá)情況。 方法：采用基因拼接(GeneSOEing)法將人類sIL-6R和IL-6的基因用一富含甘氨酸序列的接頭經(jīng)PCR擴(kuò)增融合，并定向

2、克隆至pEGFp-c1，再將Hyper-IL-6克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV，酶切線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-l在BJ5183細(xì)菌內(nèi)同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒。以酶切及PCR方法進(jìn)行鑒定后，重組腺病毒質(zhì)粒用PacI線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光以確定轉(zhuǎn)染效果。RT-PCR檢測(cè)Ad-HIL-6感染L02細(xì)胞后Hyper-IL-6基因的表達(dá)情況，Westernblot法檢測(cè)Ad-HIL-6感染L0

3、2細(xì)胞后Hyper-IL-6的蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增出1560bp的Hyper-IL-6編碼序列并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFp-cl-HIL6，經(jīng)鑒定證實(shí)構(gòu)建的融合基因的編碼序列與理論推斷完全一致。重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切后可見一條3．0kb和約30kb的條帶，表明同源重組成功。將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后于熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光。重組腺病毒Ad-HIL-6能在L02細(xì)胞中表達(dá)出Hyper-IL-

4、6基因和蛋白，條帶分別為1600bp和60KD左右。 結(jié)論：我們成功構(gòu)建了同源重組腺病毒Ad-HIL-6，并且在人類肝細(xì)胞L02中得到了Hyper-IL一6基因和蛋白的表達(dá)，為以后進(jìn)行肝再生相關(guān)疾病的基因治療等研究奠定了一定基礎(chǔ)。 第二部分Hyper-IL-6重組腺病毒對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的：研究Ad-HIL-6表達(dá)的Hyper-IL-6對(duì)HepG2細(xì)胞中急性時(shí)相蛋白一結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin)

5、mRNA表達(dá)的刺激作用；同時(shí)觀察Hyper-IL-6對(duì)人正常肝細(xì)胞的促增殖作用，為以后進(jìn)行肝再生相關(guān)疾病的的基因治療等研究奠定基礎(chǔ)。 方法：1．RT-PCR法檢測(cè)Ad-HIL-6重組腺病毒感染HepG2細(xì)胞后產(chǎn)生的急性時(shí)相蛋白一結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin)的mRNA表達(dá)的量的變化。2．MTT法檢測(cè)Ad-HIL-6重組腺病毒對(duì)人肝細(xì)胞L02生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。3．免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察L02細(xì)胞感染Ad-HIL-6重組腺病毒后其增

6、殖核抗原(PCNA)的表達(dá)情況。 結(jié)果：1．RT-PCR結(jié)果：在Ad-HIL-6重組腺病毒刺激下，HepG2細(xì)胞的結(jié)合珠蛋白的mRNA表達(dá)相比較于空腺病毒(AdO)組、Ad-IL-6組均有顯著增高(p<0．01)。 2．MTT結(jié)果：Ad-HIL-6重組腺病毒、Ad-IL-6重組腺病毒均對(duì)L02細(xì)胞有促進(jìn)生長(zhǎng)增殖的作用，但是Ad-HIL-6組的促增殖作用顯著高于Ad-IL-6組(p<0．01)。 3．免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)