重組抗腫瘤抗病毒蛋白的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、癌癥即惡性腫瘤,其主要危害是侵襲相鄰組織或向遠(yuǎn)端臟器轉(zhuǎn)移并破壞侵襲,致機(jī)體衰亡。癌癥產(chǎn)生的主要特征是正常的細(xì)胞周期和凋亡調(diào)節(jié)失控。癌癥根據(jù)組織學(xué)來源主要分為上皮癌(起源于上皮細(xì)胞)、肉瘤(起源于結(jié)締組織、骨和肌肉等)和血液腫瘤。由于各類癌癥的病程發(fā)展速度都很快,從目前的臨床實(shí)踐來看,大多數(shù)癌癥患者發(fā)現(xiàn)后為晚期,治療難度大,預(yù)后的結(jié)果不理想。因此,癌癥的治療是全球醫(yī)學(xué)界面臨的重大問題?；瘜W(xué)藥物治療在現(xiàn)代腫瘤內(nèi)科治療中具有很重要的作用,目前

2、大部分化療藥物在臨床上仍然作為一線藥在使用。但是,由于這些化療藥物對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞均有抑制或殺傷作用,導(dǎo)致化療的副作用令人難以承受,患者大多不得不使用化學(xué)藥物治療以延續(xù)生命,但并未從根本上改善患者生活質(zhì)量。
　　隨著分子生物學(xué)、基因工程的飛速發(fā)展和腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的深入研究,抗腫瘤藥物的研發(fā)也進(jìn)入了一個(gè)新的階段,出現(xiàn)了生物技術(shù)抗腫瘤藥物,因其針對性強(qiáng)、多靶向性、療效好、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)成為目前發(fā)展最快的抗腫瘤藥物研發(fā)方向之

3、一。重組抗腫瘤抗病毒蛋白是一種新型的集成干擾素(商品名:樂復(fù)能)。它是采用DNA穿梭和高通量篩選技術(shù),通過酶切等方法使12種人IFN-α亞型基因產(chǎn)生斷點(diǎn)不同、長短不一的核苷酸小片段,混合后經(jīng)過多輪PCR擴(kuò)增,不同分子的同源片段就會相互替換并隨機(jī)組合,得到大量的同源基因分子間相互雜交的新分子來構(gòu)建雜交庫,并表達(dá)出10多萬個(gè)克隆株進(jìn)行抗腫瘤、抗病毒活性的高通量篩選而得到的一株高活性人工重組干擾素的克隆株,其抗腫瘤比活性和抗病毒比活性比普通r

4、hIFN-α2b明顯提高。由于其具有抗腫瘤活性高、副作用較小且對臨床晚期惡性腫瘤的治療效果顯著等優(yōu)點(diǎn),對于改善癌癥患者預(yù)后,提高其生活質(zhì)量具有重要的意義。因此,對此類生物制品進(jìn)行質(zhì)量控制和抗腫瘤機(jī)制研究對其廣泛用于臨床實(shí)踐是至關(guān)重要的。
　　在本課題的第一部分,對重組抗腫瘤抗病毒蛋白的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究與普通干擾素rhIFN-α2b的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了對比研究。研究的具體內(nèi)容主要包括抗腫瘤活性、抗病毒活性、純度(電泳純度和HPLC純度)、蛋

5、白含量、分子量、等電點(diǎn)、外源DNA殘留量、宿主菌蛋白質(zhì)殘留量、殘余抗生素活性、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、紫外光譜、肽圖和N端氨基酸測序。本部分研究成果主要包括:根據(jù)相關(guān)的國際標(biāo)準(zhǔn)化原則(ICH、WHO相關(guān)指南和歐洲藥典等)、《重組DNA產(chǎn)品質(zhì)量控制要點(diǎn)》及2010版《中國藥典》Ⅲ部等的相關(guān)要求,進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,并選用了目前國際上通用的Daudi細(xì)胞抗腫瘤活性測定法測定了抗腫瘤活性,完成了重組抗腫瘤抗病毒蛋白的生物學(xué)活性等14個(gè)檢測項(xiàng)目的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

6、研究。研究結(jié)果顯示:①重組抗腫瘤抗病毒蛋白與rhIFN-α2b的純度、宿主菌蛋白質(zhì)殘留量、殘余抗生素活性和紫外光譜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一致的;抗腫瘤比活性、抗病毒比活性、蛋白含量、分子量、等電點(diǎn)、外源DNA殘留量、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、肽圖和N端氨基酸測序的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是不同的;②在重組抗腫瘤抗病毒蛋白與rhIFN-α2b的生物學(xué)比活性研究中發(fā)現(xiàn)二者的抗腫瘤、抗病毒比活性差異明顯:重組抗腫瘤抗病毒蛋白的抗腫瘤比活是IFN-α2b的238倍、抗病毒比活是r

7、hIFN-α2b的10倍;③重組抗腫瘤抗病毒蛋白分子量的測定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)譜測定精確分子量基本一致。④在肽圖測定方法中使用溫和的不穩(wěn)定表面活性劑RapiGestSF進(jìn)行胰蛋白酶切處理,解決了藥典方法對重組抗腫瘤抗病毒蛋白進(jìn)行酶切不充分的難題,優(yōu)化了復(fù)雜生物大分子的酶切方法。
　　在本課題的第二部分,對重組抗腫瘤抗病毒蛋白的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了研究,并和普通干擾素rhIFN-α2b進(jìn)行對比。研究主要包括體內(nèi)裸鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)、體外腫瘤細(xì)胞

8、殺傷實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期阻滯、凋亡、與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤內(nèi)血管生成相關(guān)的免疫組化、重組抗腫瘤抗病毒蛋白和rhIFN-α2b與同一干擾素受體IFNR2的親和力測定。研究結(jié)果顯示:①重組抗腫瘤抗病毒蛋白能在體內(nèi)抑制裸鼠腫瘤生長,其抑制作用明顯高于rhIFN-α2b;②重組抗腫瘤抗病毒蛋白能在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖,其抑制作用明顯高于rhIFN-α2b;③重組抗腫瘤抗病毒蛋白通過促凋亡、抑制腫瘤內(nèi)部血管生成而抑制腫瘤生長,且其促凋亡、抑制腫瘤血

9、管生成的作用強(qiáng)于rhIFN-α2b;④重組抗腫瘤抗病毒蛋白可以使細(xì)胞周期中S期發(fā)生阻滯而產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用,且其對S期阻滯的作用強(qiáng)于rhIFN-α2b;⑤重組抗腫瘤抗病毒蛋白能提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率,且其作用后腫瘤細(xì)胞的凋亡率高于rhIFN-α2b;⑥重組抗腫瘤抗病毒蛋白與受體IFNR2的親和力明顯高于rhIFN-α2b與的IFNR2親和力。
　　綜上所述,本課題對新型的集成干擾素重組抗腫瘤抗病毒蛋白與rhIFN-α2b的質(zhì)量

10、標(biāo)準(zhǔn)和抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了對比研究。其結(jié)果顯示重組抗腫瘤抗病毒蛋白的抗腫瘤、抗病毒比活性明顯高于rhIFN-α2b;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)了細(xì)胞周期S期阻滯、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和抑制腫瘤內(nèi)部的血管生成等,其在上述作用機(jī)制方面明顯強(qiáng)于rhIFN-α2b。分子水平的研究結(jié)果提示重組抗腫瘤抗病毒蛋白與IFNR2親和力比rhIFN-α2b與IFNR2親和力顯著增強(qiáng),分析其可能是重組抗腫瘤抗病毒蛋白比rhIFN-α2b比活性明顯增強(qiáng)的原因。本課題建立并