抑瘤素M對C3H10T1-2增殖及成骨分化的影響.pdf

1、[目的]
　　1.白介素-6(IL-6)家族蛋白因子抑瘤素M(OSM)對C3H10T1/2細胞系增殖的作用。
　　2.白介素-6(IL-6)家族蛋白因子抑瘤素M(OSM)對C3H10T1/2細胞系成骨分化的影響。
　　3.白介素-6(IL-6)家族蛋白因子抑瘤素M(OSM)對C3H10T1/2細胞系成骨分化過程中礦化的作用。
　　[方法]
　　1、用含不同濃度OSM的基礎培養(yǎng)液(0、5、10、20、40、8

2、0ng/ml)分組體外培養(yǎng)小鼠胚胎源性間充質干細胞(C3H10T1/2)，于48h、72h用MTS檢測法檢測不同濃度OSM對C3H10T1/2細胞體外增殖效率的影響。2、體外擴增細胞后，將C3H10T1/2細胞以1×105/ml接種于6孔板，每孔1ml細胞懸液，以基礎培養(yǎng)基補足至2ml，培養(yǎng)24h至細胞貼壁后換液。將24塊6孔板分為4組，每組6塊作同樣處理，4組分別是:(1)基礎培養(yǎng)基組（陰性對照）;(2)成骨誘導液組（陽性對照）;(3

3、)OSM(20ng/ml)組;(4)實驗組(成骨誘導液+OSM(20ng/ml))。3d、1w、2w、3w各組取一塊板提取總RNA逆轉錄為DNA，2w、3w每組另取一塊板提取總蛋白，以PCR法及Western-Blot法檢測相關成骨基因及礦化基因的表達。3、取5塊96孔板，將細胞以1×105/ml接種于96孔板，每板使用16孔，每組設置4個孔，每孔100ul，實驗分組及OSM濃度同6孔板。1w、2w、3w每組各取一板檢測堿性磷酸酶(AL

4、P)相對活性，2w、3w每組各取一板用茜素紅染色法行鈣定量分析，同時檢測成骨礦化結節(jié)的形成，以此驗證OSM對C3H10T1/2細胞成骨分化及礦化的影響。以上實驗均進行三次生物學重復。
　　[結果]
　　1.MTS法檢測不同濃度OSM對C3H10T1/2細胞增殖效率的影響:含不同濃度OSM的培養(yǎng)基作用于細胞后，與對照組比較，在48h、72h都檢測到不同濃度的OSM對C3H10T1/2細胞均有促進細胞增殖作用，且在各個時間點當O

5、SM濃度為20ng/ml時增值效率最高，48h和72h20ng/ml OSM細胞增值率達到148％和166％，20ng/ml組與其他各濃度組之間細胞增殖率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　2.RT-PCR法檢測成骨相關基因表達:半定量檢測成骨相關基因如骨形成蛋白2(BMP2)、相關轉錄因子2(RUNX2)、SP7轉錄因子(SP7)、ALP、同源轉錄因子5(DLX5)、1型膠原(COL-1)、骨粘連蛋白(ON)、骨涎蛋白(BS

6、P)、骨鈣蛋白(OC)、骨橋蛋白(OPN)等的表達。BMP-2、RUNX2、DLX5、OC、ON、BSP、COL-1、SP7均從1w末開始表達上調，持續(xù)高表達至第三周;ALP及OPN從1w末開始高表達并達到峰值，隨后時間點表達下調，但仍高于對照組;實驗組(基礎培養(yǎng)基+成骨誘導液+OSM)在設定檢測時間點的成骨基因表達與其他對照組均之間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　3.Western-Blot法檢測成骨蛋白表達:在2w、

7、3w時檢測成骨蛋白表達，在第2周和第3周均可見實驗組COL-I、OPN、BSP及OC蛋白相對含量均明顯高于其他各對照組。
　　4.堿性磷酸酶(ALP)活性測定:接種C3H10T1/2于96孔板，分別于1、2、3w以酶標法檢測堿性磷酸酶ALP的活性。驗組及OSM組于第1周ALP相對表達量達最高值，隨后表達下降;陽性對照組ALP相對表達量于第2周達峰值，各實驗組相對陰性對照組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　5.鈣染色與相對鈣

8、定量檢測:接種C3H10T1/2于96孔板，分別于2w、3w檢測各分組鈣染色、礦化結節(jié)形成及鈣定量分析。實驗組在2w和3w相對鈣定量分別達到陰性對照組8倍和40倍，有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;陽性對照組及OSM組在設定時間點鈣定量分析與陰性對照組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);分別于2w、3w用茜素紅染色法檢測各分組鈣染色及礦化結節(jié)形成，結果顯示實驗組從第2周開始形成少量鈣結節(jié)，第3周可見視野中大量鈣結節(jié)形成;其余組2w和3w時