信號素3A對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響.pdf

1、目的：⑴研究信號素3A（Semaphorin3A，Sema3A）對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)增殖和成骨分化的影響；⑵探討ERK信號通路在Sema3A對SD大鼠BMSCs成骨向分化影響中的作用。
　　方法：①使用重組Sema3A因子（0.5ug/ml和1ug/ml）處理細(xì)胞，采用MTT法檢測Sema3A對BMSCs增殖的影響；3d后，采用實(shí)時(shí)熒光定量P

2、CR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測BMSCs成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶(ALP),骨鈣素（OCN）及Runx2mRNA表達(dá)的變化；7d后采用酶比活性法檢測細(xì)胞ALP活性；14d后用茜素紅染色法檢測Sema3A對BMSCs形成礦化結(jié)節(jié)的影響。②使用重組Sema3A因子處理細(xì)胞3d后，Western Blot法檢測ERK1/2以及p-ERK1/2蛋白水平的變化。加入ERK1/2信號通路特異性抑制劑

3、 PD98059后再用Sema3A處理細(xì)胞，作用3d后用Western Blot法檢測ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平以及qRT-PCR法檢測成骨相關(guān)基因的變化；處理細(xì)胞7d后，茜素紅染色法檢測礦化結(jié)節(jié)的形成。
　　結(jié)果：⑴使用重組Sema3A因子處理BMSCs后，MTT結(jié)果顯示Sema3A因子對BMSCs的增殖無明顯影響；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示在兩個濃度的Sema3A處理組BMSCs成骨相關(guān)的基因ALP,OCN和Run

4、x2mRNA的表達(dá)量均比對照組低（P＜0.05）；細(xì)胞堿性磷酸酶活性在Sema3A處理組比對照組降低（P＜0.05）；茜素紅染色結(jié)果顯示BMSCs經(jīng)Sema3A處理后礦化結(jié)節(jié)形成的量明顯減少。⑵Western Blot結(jié)果顯示ERK1/2蛋白磷酸化水平在成骨誘導(dǎo)組降低，而Sema3A處理細(xì)胞后可以使其水平升高。用ERK1/2信號通路特異性抑制劑 PD98059處理細(xì)胞后， ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯降低。Sema3A顯著抑制ALP,